转录是基因表达的核心环节，其动态过程（如RNA聚合酶的结合、启动子解旋、增强子激活）与细胞命运决定、疾病发生密切相关。传统研究方法（如ChIP-seq、GRO-seq）虽能揭示转录相关蛋白结合或新生RNA水平，但存在细胞起始量要求高（需数百万细胞）、无法直接反映DNA单链状态（转录泡形成的关键标志）等局限。例如，增强子作为调控基因表达的顺式元件，其转录活性与DNA单链结构的关联一直难以在全基因组水平解析。
芝加哥大学何川团队开发的Kethoxal辅助单链DNA测序技术（KAS-seq），为这一领域带来了突破性解决方案。相关成果发表于《Nature Methods》（2020年），揭示了转录调控与增强子功能的全新机制。
1. 单链DNA标记的化学核心
KAS-seq基于叠氮基乙氧二羟丁酮（N₃-kethoxal）的独特化学性质：
1) 高特异性：仅与单链DNA（ssDNA）中的鸟嘌呤（G）反应，双链DNA因碱基配对阻断结合，避免背景干扰。
2) 快速高效：5分钟内即可在活细胞或小鼠组织中完成标记，保留瞬时转录事件的原始状态。
在DAMM-seq诞生前，RNA甲基化检测面临两大核心难题：
2. 全基因组捕获与分析流程
1) 标记与富集：N₃-kethoxal标记后，通过生物素-链霉亲和素磁珠富集ssDNA片段，结合高通量测序实现全基因组单链区域定位。
2) 低起始量兼容：仅需1000个细胞或小鼠组织样本，即可完成测序，适用于稀有细胞（如干细胞、临床样本）研究。
1. 转录泡的全基因组图谱
KAS-seq首次在全基因组范围内可视化转录泡（转录活跃区域的ssDNA结构），发现：
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启动子与终止子的特异性信号：在转录起始位点（TSS）和终止位点（TES）附近呈现强单链信号，与Pol II结合及转录延伸高度相关。
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动态响应药物干预：用DRB（Pol II释放抑制剂）处理后，TSS附近单链信号增强，基因体区域信号减弱，印证转录泡形成与Pol II活性的直接关联。
2. 增强子的单链状态与功能激活
约25%的增强子呈现单链结构（称为SSEs，单链DNA增强子），其特征包括：
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高转录活性：94%的超级增强子属于SSEs，且与H3K27ac（活性染色质标记）高度共定位。
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独特序列基序与转录因子结合：SSEs富集特定转录因子（如Brd4、CTCF）结合基序，提示其通过招募调控蛋白增强靶基因表达。
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三维基因组互作：SSEs与启动子的长程互作（通过CTCF/Pol II介导）显著多于双链增强子，揭示单链结构对增强子-启动子通讯的重要性。
3. 转录调控的动态响应机制
利用1,6-己二醇破坏蛋白质凝聚体（转录激活相关结构）后，KAS-seq发现：
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Pol II快速释放现象：5分钟内，Pol II从启动子向基因体区域移动，伴随TSS附近ssDNA信号减弱，提示蛋白质凝聚体对Pol II的锚定作用。
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磷酸化依赖性调控：Pol II的CTD丝氨酸5磷酸化水平（S5P）与释放效率正相关，揭示转录起始-延伸转换的分子机制。
1. 基础生物学研究
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解析转录异质性：在干细胞分化、肿瘤细胞转录重编程中，定位动态ssDNA区域，揭示细胞命运决定的关键节点。
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非编码RNA与染色质互作：结合eRNA转录与ssDNA结构，阐明增强子RNA（eRNA）的作用机制。
2. 疾病机制与生物标志物发现
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癌症转录异常：检测癌基因启动子的ssDNA过度暴露，筛选潜在转录靶向药物（如Pol II抑制剂）。
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罕见病样本分析：利用低起始量优势，从临床穿刺样本中解析致病基因的转录动态。
3. 技术联用与拓展
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多组学整合：结合ATAC-seq（染色质可及性）、Hi-C（三维基因组），构建转录调控的多维图谱。
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实时动态追踪：开发荧光标记的kethoxal类似物，实现活细胞内ssDNA结构的实时成像。
KAS-seq通过化学标记与高通量测序的巧妙结合，首次实现了低样本量、高灵敏度、全基因组的ssDNA检测，为转录动态与增强子功能研究提供了“金标准”。其技术创新性不仅体现在方法学突破，更在于揭示了转录调控中“结构-功能”的深层关联——单链DNA不仅是转录的副产物，更是基因表达调控的主动参与者。
随着技术的进一步优化（如空间分辨率提升、多物种兼容性扩展），KAS-seq有望在发育生物学、肿瘤精准医疗等领域引发新的研究热潮，为解码生命调控网络提供强大工具。
KAS-seq
KAS-seq（N3-乙氧基乙醛辅助单链DNA测序）服务是基于创新单链DNA（ssDNA）标记技术的全基因组分析解决方案。该技术通过特异性小分子N3-kethoxal高效标记细胞内动态形成的ssDNA区域，精准捕获转录过程中RNA聚合酶诱导的转录泡及增强子活性区域，实现全基因组范围内转录动态的高分辨率解析。
技术支持联系电话：021-5707 2015
技术支持联系邮箱：service2m@sangon.com
[1] Wu,T.,Lyu,R.,You,Q.,&He,C.(2020).Kethoxal-assisted single-stranded DNA sequencing captures global transcription dynamics and enhancer activity in situ. *Nature Methods, 17*(5), 515-523.
