文章总体思路

Fig.1 SRYK1在胰腺癌组织中表达上调，STYK1敲除减缓胰腺癌进程

为了深入阐明STYK1在胰腺癌肿瘤发生中的分子机制，作者对稳定转染STYK1 shRNA的胰腺癌细胞进行全基因组RNA测序。基因本体（Gene Ontology)富集分析显示，STYK1的缺失会改变Wnt/β-catenin信号通路的调控，而这一通路被认为与胰腺癌的进展密切相关。在AsPC-1和PANC-1这两种胰腺导管腺癌（PDAC）模型中，TOPflash/FOPflash双荧光素酶报告实验显示，STYK1缺失可显著抑制β-catenin的基础转录活性以及Wnt3a刺激所诱导的转录激活。而STYK1过表达可增强β-catenin在核内的积累。这些结果表明，STYK1通过调节Wnt/β-catenin信号通路进而调节胰腺癌进展。

Fig.2 STYK1促进Wnt/β-catenin信号通路激活

Fig.3 STYK1和GSK3β、β-catenin具有相互作用

接下里，作者进一步研究STYK1和GSK3β、β-catenin之间的作用机理。先前的研究发现，STYK1 部分定位于细胞膜，胞内部分则与 Rab5 或 Rab7 阳性（Rab5⁺/Rab7⁺）多囊泡体（MVBs）共定位，而这些MVBs与 GSK3β 的隔离有关。因此，作者猜测STYK1会影响MVBs对GSK3β 的隔离。因此，作者构建了一个Rab5 Q79L突变体以诱导形成扩大的晚期内体囊腔，并分析了Rab5 Q79L表达细胞中GSK3β的亚细胞分布。结果表明，Wnt3a会显著促进GSK3β进入MVBs中，而STYK1的缺失会逆转这一过程。

Fig.4 Wnt3a会显著促进GSK3β进入MVBs中，而STYK1的缺失会逆转这一过程。

为探究 STYK1-β-catenin 或 STYK1-GSK3β 相互作用在 GSK3β 隔离及其后续 Wnt/β-catenin 信号传导中的作用，作者设计了能够特异性破坏 STYK1 与 β-catenin 或GSK3β 结合的短肽，并通过Biacore实验验证其效果。接下来，作者检测这些短肽对于GSK3β以及Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果表明，这些短肽抑制GSK3β进入MVBs，并促进了GSK3β, Axin1, and β-catenin之间的相互作用以及随后β-catenin的降解。这些结果表明，STYK1 -β-catenin或STYK1-GSK3β相互作用对于STYK1介导的GSK3β隔离和随后的Wnt/β-catenin信号传导激活至关重要。进一步的研究也表明这些阻断肽会抑制移植瘤的生长，增加肿瘤异种移植瘤小鼠的生存期。

Fig.5 活性短肽抑制GSK3β进入MVBs，并促进了GSK3β, Axin1, and β-catenin之间的相互作用以及随后β-catenin的降解。

综上，作者通过多种体外和体内实验，发现STYK1的高表达与胰腺癌生存率低有关，并且STYK1缺失抑制胰腺癌细胞的生长。此外，作者还阐明了STYK1通过与GSK3β和β-catenin结合来激活Wnt/β-catenin信号传导的作用。clathrin/ AP2介导的STYK1内化和GSK3β隔离在β-catenin复合体的失活和随后的Wnt/β-catenin信号传导中发挥了重要作用。

在疾病机制研究中，蛋白作为生命活动的关键分子，其功能和相互作用在疾病的发生发展中扮演着重要的作用。因此，深入研究蛋白质的结构和功能，对于揭示疾病发生，通路机制以及研发有效的治疗策略具有重要的意义。在这一过程中，蛋白纯化是不可或缺的关键步骤。掌握成熟的纯化方法并得到足量的高纯度高活性的蛋白，无论是对于蛋白功能，相互作用，或者蛋白结构研究都非常重要。如果你还没有接触过蛋白纯化，或者在纯化中遇到一些难题，在蛋白纯化主题日中都能找到方法和答案。

在NCBI上查找STYK1 ICD序列（aa 26-422），设计引物PCR扩增目标基因片段；将目标片段和克隆载体pGEX4T-1（28954549）（如果是His标签，可以选择pET-28a克隆载体）分别使用限制性内切酶进行酶切，并使用T4连接酶（UA070047）进行连接。

构建好的重组质粒转入E.coli TOP 10感受态细胞进行质粒扩增和鉴定，鉴定后的重组质粒转入E. coli strain BL21 (DE3)进行表达。

包含重组质粒的E. coli strain BL21 (DE3)菌株接种到5ml包含70 μg/ml ampicillin的LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养。过夜的培养基接种到50ml包含70 μg/ml ampicillin（abs811912）(diluted 1:100)的LB培养基中，培养至OD600 =0.4–0.6。

加入0.2 mM IPTG（abs811970）进行诱导表达37℃，5h。大肠杆菌菌体通过离心收集（12,000g for 3 min），细胞沉淀用裂解液进行重悬，然后冰上超声100次（sonicated 5 s with 5 s intervals between each pulse）。

30,000g 离心30 min，取上清用0.45μm滤膜（4604）过滤。

GST标签：

结合缓冲液：PBS, pH7.3

洗脱缓冲液：50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione,pH 8.0 

His标签：

结合缓冲液：20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl，20 to 40 mM imidazole, pH 7.4 

洗脱缓冲液：20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.4 

润洗滤膜并放入重力空柱（17043501）中，加入1ml GST填料（17075601）用结合缓冲液平衡3次。加入2ml结合缓冲液到填料中重悬制备填料悬液，然后将样品和填料悬液混合，并放入离心管中摇晃孵育1-2h。

将样品和填料悬液混合物倒入层析空柱，将层析柱竖直放置在试管架上。加入5ml结合缓冲液洗杂。

加入3-5ml洗脱缓冲液进行目标蛋白洗脱，收集流出液。收集物使用SDS-PAGE（abs9600）跑胶鉴定。