生工技术 | gRNA筛选和病毒包装感染目的细胞系

 

之前小编介绍了CRISPR Cas9 基因敲除sgRNA设计和载体构建（sgRNA设计）。设计好的sgRNA还需要实验验证其有效性，保证gRNA可以工作后，然后将含有gRNA和Cas9基因的载体导入细胞，在gRNA的引导下，Cas9蛋白实现精准的基因编辑。这一期，主要介绍gRNA的筛选和通过慢病毒载体实现gRNA/Cas9细胞导入。

 

 

 

“

gRNA筛选方法

”

 

 

 

1

体外检测法

 

 

 

一般我们会设计三条gRNA，gRNA设计好后，通过体外转录将gRNA转录出来，然后在体外gRNA的引导下Cas9蛋白定向切割目的基因。具体的操作流程是利用人工表达的Cas9蛋白和体外转录的gRNA，定向切割从基因组扩增出的编辑序列，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析结果。

 

1.1 sgRNA体外转录

 

 

1.2 sgRNA引导的Cas9定向切割

 

 

 

上述Cas9蛋白可以通过表达纯化获得，目前市面上已经有成熟的体外转录验证sgRNA有效性的试剂盒。具体的操作可以根据试剂盒操作说明。

 

 

2

测序检测

 

 

 

将表达Cas9和sgRNA的质粒瞬时转染至目的细胞系进行基因编辑，转染48 h后便可以抽提细胞基因组DNA，然后以基因组DNA为模板扩增包含剪切位点的序列（500~700bp），将PCR产物连接到T载体，转化后进行菌落PCR扩增插入片段，测序分析，确认编辑序列。

 

 

 

“

gRNA/Cas9细胞导入

”

 

 

确定gRNA有效性后，便可以进行后续的基因编辑实验。

 

gRNA/Cas9可以通过多种手段导入目的细胞系，这部分主要介绍利用慢病毒感染目的细胞系，进行目的细胞的基因编辑。

 

“

慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷I型病毒（HIV-1）发展起来的病毒载体。区别于腺病毒载体和腺相关病毒载体，慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞都有侵染能力，并且可以整合到基因组上，所以慢病毒载体可以用于shRNA，sgRNA，过表达基因载体的构建，然后通过病毒包装感染目的细胞系，实现目的基因的敲低，敲除和过表达。

”

 

慢病毒表达包括病毒质粒构建、共转染293T细胞、收集浓缩病毒液、感染目的细胞系。为了产生安全高滴度的慢病毒，目前常用的慢病毒包装采用三质粒表达系统和四质粒表达系统。下面以构建好的CRISPR敲除载体为例，介绍三质粒包装慢病毒并且感染目的细胞系实现目的细胞基因敲除。

 

 

1

慢病毒包装

 

 

1. 准备已经构建好的敲除质粒（sgRNA plasmid）、包装质粒（REV）和包膜质粒（VSVG）。

2. 将上述三质粒共转染293T细胞， sgRNA plasmid：VSVG ：REV=5：3：2。不同包装系统选择的载体和比例都不同，此系统只作为参考。

3. 293T细胞培养48h后收集病毒液，存在在-80℃。

4. 继续培养24h后，收集病毒液，将两批病毒混合，浓缩、检测病毒滴度。

 

 

2

病毒感染目的细胞系

 

 

通过质粒上的抗性基因筛选侵染成功的细胞pool，通过流式细胞仪筛选出含有GFP绿色荧光的单细胞，扩大培养。

 

 

3

敲除细胞系的验证

 

 

可以提取基因组DNA扩增测序，或利用western blot实验验证目的基因在细胞系的敲除情况。确证的稳定敲除细胞系便可用于后续功能实验。

 

生工生物可以帮客户包装多种类型的病毒，欢迎咨询。