今天我们就来简要说说环状RNA怎么来进行过表达。
环状RNA的成环机制
在讲过表达之前我们先来看看环状RNA的成环机制。目前环状RNA成环机制有以下三种:
大家都知道，环状RNA来源于pre-mRNA,此时同时存在内含子与外显子。在与成环序列的侧翼内含子上，存在着反向互补序列（例如哺乳动物中的Alu序列），当外显子侧翼的互补的序列结合在一起时，外显子的5端序列剪切供体体与3端剪切受体结合，形成环状RNA
Detecting and characterizing circular RNAs
在可变剪切过程中，外显子发生跳跃，形成了套索结构，拉近了剪切位点序列之间的距离，最后通过剪切，形成环状
Detecting and characterizing circular RNAs
有研究表明，有的环状RNA的形成受到RNA结合蛋白或者剪切因子的调控。它们能结合到侧翼的内含子上，从而调节环状RNA的形成。
环状RNA过表达载体的构建
从成环机制可以看出，侧翼序列对于cicrRNA成环很重要，因此这段序列对我们能否过表达成功起着关键作用。但在通用的载体是没有这段序列，因此只能自己改造质粒或者直接购买商业化质粒。
按照成环机制来看，我们有两种方法可以进行载体构建。
1. 直接把两段特定的侧翼序列连接到载体上，然后根据需要插入目的基因；
2. 直接通过PCR把目的基因及其侧翼序列一起连接到载体上；
3. 使用商业化环状RNA表达载体。
有人按照第一种方法构建了空载体pcDNA3.1(+) CircRNA Mini Vector，文献作者通过把ZKSCAN1的外显子2与3及其侧翼序列连接到pcDNA3.1(+)载体上，通过逐步删除侧翼序列的碱基，然后看环状RNA的表达情况，得到了最短的一段反向重复序列。加入的片段如下（绿色为Alu序列、灰色为剪切位点、蓝色为DNA插入的位置）
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但是这个载体加入的序列太短，可能不是普遍适合所有环状RNA。
第二种是小编认为是最保险的一种方法，毕竟原装才是最适配的。一般需要选择含有重复序列（Alu元件）的200-1000bp的侧翼序列，同时加上外显子一起扩增出片段，连接到载体上。唯一不理想的就是目的片段太大，不是特别容易扩增。
相较于这两种方法，各有优缺，大家可以根据自己需要选择。
最后，若是经费允许，建议直接购买商业化质粒，例如pLCDH-ciR等。商业的质粒不仅添加了侧翼互补序列，一般还会添加RNA结合蛋白的基因序列，从而调节cicrRNA的表达量。
参考文献
1. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs.
2. Complementary Sequence-Mediated Exon Circularization.
3. Detecting and characterizing circular RNAs.
4. Circular RNA profiling reveals an abundantcirc HIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs.
5. circRNA Biogenesis Competes with Pre-mRNA Splicing.
6. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production.
