胶体金是一种在免疫学和材料学常用的原料。为了认识胶体金，首先我们来了解下什么是胶体。胶体一种较均匀的混合物，在胶体中存在两种不同状态的物质，其一为分散剂，比如水。另一种为分散质，就是金纳米颗粒。分散质金纳米颗粒的直径在1-100 nm之间。这个直径大小比溶液中分子量的直径要大不少。

   胶体金的原料则是氯金酸HAuCl₄，氯金酸在水中会形成溶液状态，颗粒大小低于1 nm，那么氯金酸分子是怎样形成颗粒较大的胶体金的呢？这要从胶体金的制备过程说起：取0.01 %的氯金酸100 ml加热至煮沸，然后加入一定量的1% 柠檬酸三钠溶液。持续进行加热，一开始为蓝色，后续转化为红色，5 min后开始形成透明的红色胶体金溶液^[1]。

     在这个过程中，三价的金离子被还原成零价的金原子，被称为Au Seed，我这里翻译成种子金。种子金的作用就像人工降雨里的碘化银凝结核，所不同的是，碘化银吸收的是水，而种子金吸收的是未进行还原的的柠檬酸分子^[2]。

柠檬酸分子上的羧酸电离后带有负电，除了能与种子金形成化学键，还可以与未被还原的氯金酸中的金原子形成化学键^[3]。

多个金原子之间通过化学键紧密的结合到一起。开始形成金原子簇，最后联合成为金纳米颗粒^[4]。

下图左侧的照片的展示要更直观一些，所谓的胶体金并非是单独的一个金原子，而是由多个金原子以及柠檬酸的聚合物。这些金原子颗粒的数量肉眼看过去也比较舒适，不至于产生密集恐惧症。除了球状的的金纳米颗粒，金纳米颗粒也可能形成下图右侧中的形状。这些形状是计算机模拟不同金原子数量的金纳米颗粒的结果^[5]，不少看起来像是魔方或是骰子，甚至可以联想为桑葚，大概小编已经饿了。

完成了上述胶体金的制备过程，怎么样去判断已经得到了成功的胶体金呢，有下面两种方案。第一种办法比较简便，即通过丁达尔现象来进行观测。所谓丁达尔现象，是当一束光线透过胶体，从垂直入射光方向可以观察到胶体里出现的一条光亮的“通路”。这是由于光在金纳米颗粒的表面发生散射的结果，而在黄色的氯金酸溶液中，由于氯金酸颗粒较小，散射作用较弱，不容易被观察到。

第二种办法则需要借助大型仪器投射电子显微镜（TEM），这种办法不仅能直接观察到金纳米颗粒的存在，还能确定金纳米颗粒的大小^[6]。实际上，金纳米颗粒的大小和加入还原剂柠檬酸钠的量有关系，在保持氯金酸加量不变的前提下，柠檬酸钠加入的越多，所形成的金纳米颗粒越小。柠檬酸钠加入的越少，所形成的金纳米颗粒越大。小编这里的理解是，因为体系中加入氯金酸的量是固定的，越多的还原剂可以形成更多的种子金，产生更多的金纳米颗粒中心（“山头”），这样最后形成的金纳米颗粒大小也就越小。而越少的金纳米颗粒中心（“山头”）就能够吸引更多的金原子，产生更大的金纳米颗粒。

不同颗粒大小的胶体金都带有颜色，这个颜色的产生是由于胶体金吸收了可见光中的一部分造成的。我们把金纳米颗粒想象成下图中的黄色球体，而金纳米颗粒中的电子则位于球体的表面。金纳米颗粒的大小远小于可见光的波长（400-760 nm），这些电子在入射光产生的电场的影响下朝着相反的反向进行振动。当光线照射到金纳米颗粒表面时，如果入射光的频率和金属纳米颗粒表面电子震荡的频率相同时，就会产生共振。金纳米颗粒对入射光产生很强的吸收作用，这种现象被称为局域表面等离子体共振（LSPR，localized Surface Plasmon Resonance）^[7]。等离子体就是我们刚刚提到的在金属表面的电子。

那么，是不是所有的金属表面都会发生局域等离子体共振呢？实际上，这个现象只存在于贵金属中，比如金，银，铜，铂和钯^[8]。我们可以看到金纳米颗粒在可见光范围有较大的吸收范围，比较适合在可见光范围内进行检测。且银、铜容易被氧化形成氧化膜，影响局域等离子体共振的发生。而金不容易被氧化，相比银、铜更加稳定。

胶体金颜色会受到金纳米颗粒的大小的影响，随着金纳米颗粒大小的变大，它的最大吸收波长逐渐变大，外观颜色也从红色向紫色方向转移。下图中从左到右展示的是从4 nm到40 nm大小的金纳米颗粒颜色的变化^[9]。从LSPR的原理上来说，金纳米颗粒越大，其表面电子距离核心的距离也就越远，变得更加容易发生震荡。震荡所需的能量越小，与入射光发生共振的光的频率也就越低，入射光发生共振的光波长也就越大。

在具体讲述连接办法之前，我们先回顾下DNA的基本性质。下图显示的是5’- ATGC-3’的寡核苷酸，即使DNA上未进行任何修饰，金纳米颗粒AuNP也会对其产生强烈的吸附作用，吸附作用从强到弱分别为A> C> G> T >>磷酸。碱基在PH5到8之间呈现电中性，腺嘌呤A和胞嘧啶C在PH 3.5和4.2时会获得质子从而带一个正电，鸟嘌呤G在PH 2.1时才发生质子化，这都需要相当低的PH才会发生，而这样的PH在常规实验中是不会遇到的。通常情况下，DNA是带大量负电荷的聚合物^[10]。

如果只是借助AuNP对DNA的吸附，通常情况下，会在DNA序列的一端带有PolyA的结构，PolyA负责与AuNPs的结合，其余部分序列参与杂交过程。大部分情况下，AuNP与DNA的连接过程是通过AuNP的DNA上巯基之间的金硫键来完成的。由于DNA和AuNPs都带负电荷，会受到金纳米颗粒的负电和DNA所带有的负电的排斥力影响，导致两者很难形成金硫键。

为了解决负电排斥力的影响，最好的方式就是在体系中加入带有正电的钠离子。这个方式和PCR体系中加入钠离子类似，两条互补单链DNA都带有负电，在体系中加入钠离子中和负电荷，便于两条互补单链DNA形成氢键，使得引物更容易结合在模板DNA上。同理，在AuNP交联应用中，正电的钠离子中和AuNP和DNA链上带有的负电荷。但如果一下把钠离子浓度提的太高（1 M），在AuNP和DNA形成金硫键之前，AuNP之间由于电荷消除的影响导致不可逆转的uNP聚集，溶液从红色变为蓝紫色，导致实验失败。最早进行AuNP研究的Mirkin实验室^[11]的解决方案是这样：使用加盐老化（salt aging）的办法，逐步提高氯化钠的浓度。同时修饰FAM和巯基修饰的DNA在临用前，DNA之间的二硫键使用DTT进行还原，将含有DTT的溶液（0.1 M DTT, 0.18 M phosphate buffer (PB), pH 8.0）直接用于溶解DNA干粉。被还原的DNA使用NAP-5纯化柱（脱盐柱）进行纯化。刚还原的DNA加入到AuNP中（浓度1 OD/1 mL），并调节体系中PB和SDS的终浓度为为0.01 M和0.01% 。DNA和AuNP的混合物在室温下静置20 min，使用2M NaCl，0.01 M PB，0.01% SDS加入到这个混合物中，使得钠离子浓度提高到 0.05 M。静置20 min，接下来将混合物进行超声 10 s以分散纳米颗粒。然后再次加入2M NaCl，0.01 M PB，0.01% SDS溶液，重复加入NaCl使得体系中的钠离子浓度以0.1M的梯度进行上升，并最终达到1 M这个浓度。最后AuNP在室温下放置过夜。为了去除多余未连接的DNA，将AuNP进行离心并去掉上清，然后使用0.01 %的SDS进行重悬，清洗步骤共进行5次以彻底去除多余的未连接DNA。

在这个过程中，加入带有负电的DNA连接到AuNP上，实际上提高了AuNP对钠离子的稳定性，原始的AuNP只能耐受50 mM的NaCl，在连接了DNA之后，在1 M NaCl下也能保持稳定。盐老化的原理如上图A所示。最初，只有少数DNA分子通过硫醇基或某些碱基被吸附。这是可能的，因为总DNA密度非常低。这些最初吸附的DNA分子增加了AuNPs的负电荷密度，并排斥已经连接DNA的AuNPs，而不是裸AuNPs。AuNPs-DNA复合物的稳定性优于裸AuNPs。着添加更多的NaCl，更多的DNA被吸附，直到达到新的静电斥力平衡。这些新吸附的DNA分子进一步提高了耐受更多NaCl的能力。在这种盐老化过程中，巯基逐渐取代了吸附在AuNPs上的DNA碱基，从而使DNA站立起来。在该过程的后期，盐的主要作用是减少AuNP上DNA之间的排斥，从而可以实现超高密度。

对于典型的成功实验，AuNPs的颜色在整个过程中应保持红色。有时AuNPs与DNA混合后立即聚集，甚至在不加盐的情况下。这说明DNA中存在杂质，可以使用Sep-Pak柱或其他方法通过脱盐步骤将其去除以纯化DNA。有时，AuNPs在盐老化过程中会变成紫色。在这种情况下，DNA介导的自聚沉是可能的。为了对此进行检查，可以将聚沉的样品离心以除去上清液，然后将其重新分散在纯水中。如果AuNPs可以完全恢复为与分散的AuNP相同的红色，这意味着DNA序列可以自我杂交。这对于颗粒较大的AuNPs尤其是个问题，因为它们具有更大的DNA相互配对的区域（上图B）。仅需要三到四个碱基对就能完成自我杂交的过程， 因此，需要仔细的序列设计以避免这种影响。例如，在上图C所示的两个序列中，DNA1对这种自聚沉具有抗性，而DNA2则倾向于这种自聚沉。然而，当以较低的盐浓度进行以抑制自聚沉时，这种AuNPs仍可用用于和DNA完成连接。只要保持盐浓度足够低（或在更高的温度下），这样就不会发生自聚集。

除了之前加盐老化使AuNPs与巯基DNA连接的办法，还有一种方案是在PH 3.0的柠檬酸溶液中进行纳米金颗粒与DNA的连接^[12]。在下图中，首先将纳米金颗粒和DNA混合，但是不加入NaCl。将PH分别调解到7.6和3.0。然后加入0.3 M NaCl，可以观察到PH 7.6的那管颜色开始发紫，但是PH 3.0的那管依然保持鲜红。孵育3 min后，接下来将混合物分别离心，去掉上清，然后加入300 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7.6，可以观察到初始PH 7.6 金纳米颗粒开始明显聚集。而初始PH 3.0的那管依然保持红色，即使把NaCl 浓度提高到1 M，颜色依然不变。这说明左侧的管中DNA没有与纳米金相连，因此它对钠离子的耐受性很弱。而右侧管中的DNA已经成功与纳米金相连，它可以耐受1 M的钠离子。

在纳米金颗粒上修饰DNA后，正常情况应该如上图的右侧那管一样，还是鲜红色。这是因为修饰DNA对纳米金颗粒的大小影响不大。以13 nm直径的纳米金颗粒为例，直径大约从13 nm提升到18 nm左右。

该方法的基础是DNA碱基的质子化。即，腺嘌呤和胞嘧啶可以在pH 3下被质子化。质子化的碱基减少DNA和AuNP之间的排斥，更重要的是，减少AuNP上DNA链之间的排斥。因此，如果DNA富含鸟嘌呤和胸腺嘧啶，则这种低pH值的方法不太可能奏效。

生工提供商品化的巯基修饰DNA包含两种形式，游离硫醇（free thiol，修饰代码为SH CN）和二硫化物（disulfide，修饰代码为HS-SH CN）。游离硫醇修饰的DNA容易形成分子间二硫键导致二聚体。二硫化物修饰的DNA是巯基被保护的结构。为了得到裸露的巯基，在临用前需要使用还原剂DTT或者TCEP进行还原处理。

使用DTT的还原办法参考前文盐老化的章节，由于DTT本身也是含有巯基的分子，在于AuNP连接之前，需要通过脱盐柱等办法去除DTT。TCEP不含有巯基，因此使用TCEP还原的办法不需要去除TCEP，且TCEP对AuNP的亲和力不高。可将 200 μl 的15 μM的巯基修饰的DNA与 5 μl 的1 M 的TCEP混合，室温下还原30 min。后续可以直接与AuNP混合^[13]。

5'SH C6还原前后结构  5'HS-SH C6还原前后结构

当使用TCEP还原二硫化物修饰的DNA，切割下来的保护剂碎片仍然残留下体系中，它也会吸附在AuNP上。在13 nm AuNP上，可以吸附1200个巯基。但是，由于DNA分子的空间位阻，它只能吸附100个DNA分子。因此，AuNPs上有足够的空间吸附切割下来的保护剂碎片(下图A)。对于完全裂解和纯化的DNA样品，与AuNP连接的性能可能会更好， 特别是对于那些难以连接的DNA样品(下图B) 。

巯基与DNA之间可以通过增加空间的办法减少AuNP和DNA之间的空间位阻，最先使用的办法是通过加入一段重复的碱基， 由于AuNP对碱基的吸附能力从大到小为 A> C> G> T，通常使用PolyT提升空间距离。PolyT的碱基长度通常为10，将碱基长度从10提升到20，对DNA链与其它链杂交时的Tm值提高不大^[14]。PEG修饰（对应生工的spacer 18）的DNA相比重复的碱基能提高AuNP上巯基修饰DNA的数量，这是由于PEG是电中性的，能够避免碱基与AuNP静电排斥作用^[15]。Dithilol(DTPA)修饰含有两个巯基，在竞争性的硫醇如巯基乙醇或DTT存在的情况下，相比单巯基修饰AuNP复合物更稳定^[16]。