糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白（GITR）在调节T细胞的效应功能中发挥关键作用。然而，在临床试验中GITR激动剂抗体治疗效果有限，或许与介导的信号传导不佳有关。为突破限制，作者设计了PD-1-GITR-L双抗作为GITR激动剂用于癌症免疫治疗。我们来一起学习nature cancer的这篇《An anti-PD-1–GITR-L bispecific agonist induces GITR clustering-mediated T cell activation for cancer immunotherapy》。

PD-1-GITR-L双抗诱导PD-1依赖和FcγR不依赖的GITR聚集，从而增强启动抗原特异性GITR⁺PD-1⁺ T细胞的激活、增殖和记忆分化。是一种PD-1导向的GITR-L结构，在同基因、基因工程和异种移植人源化小鼠肿瘤模型中显示了剂量依赖的、免疫驱动的肿瘤生长抑制，靶饱和与记忆T细胞Ki67和TIGIT上调之间存在剂量依赖性。

为比较不同GITR受体聚集水平相对应的T细胞共刺激信号，作者设计了不同的结构。基于GITR-1和抗GITR的结构表现出最佳的寡聚和生物活性。十二价的GITR-L六聚体Fc结构可观察到T细胞活性显著增加，IL-2和IFN-γ分泌增加。十二价抗GITR-L六聚体比抗GITR抗体表现出更高的活性，这表明GITR信号可以独立于FcγR而诱导。基于这一机制，作者设计了抗PD-1–GITR-L双特异性抗体，其中抗PD-L1增强GITR聚集和NFκB信号。抗PD-1/GITR-L双抗在NFκB-GITR+Jurkat细胞中诱导了更高水平的NF-κB信号。将10万个细胞接种在96孔的平底板中，并对抗体进行连续稀释。24小时后，使用BriteLitePlus（6066761，PerkinElmer）定量荧光素酶活性。Jurkat-NFκB-GITR+稳定细胞。对转导的细胞进行分类，筛选人GITR和NFκB的表达，然后与抗CD3孵育48h，诱导PD-1表达上调。

随后，作者通过流式细胞术证实，TCR激活的T细胞上，PD-1和GITR共表达。根据信使RNA测序（mRNA-seq）分析和免疫组化（IHC），在不同的癌症适应症中，肿瘤浸润淋巴细胞中也发现了较高的PD-1和GITR表达水平。

随后，作者在小鼠模型中及在体外人类PBMC刺激试验中测试抗PD-1/GITR-L双抗的抗肿瘤效果。抗PD-1-GITR-L双特异性与单药和同期组合的效果相比，具有不同的MoA。比较了与抗PD-1和GITR-L的单药以及1:1联合用药。结果显示，相比于单药和联合给药，抗PD-1/GITR-L双抗显示出最佳的抗肿瘤效果。

在人外周血单核细胞共刺激试验中，与单药和1:1联合给药相比，抗PD-1/GITR-L导致PBMC剂量依赖性增殖、IFN-γ、IL-2和TNF-β增强。PBMCs，2×10⁵细胞/孔，96孔U底板，含有0.5µgml-1抗人CD3。48h和96h后，收集上清液，使用AlphaLISA技术分析IFN-γ和IL-2（PerkinElmer）。对于自体MLR，树突状细胞（DCs）通过培养1×10⁸粘附的PBMCs与4.8µg GM-CSF，3µg IL-4（7天）和12ngIL-1α和TNF-α（5天）获得。第7天，收集树突状细胞，在414Rmin^-1条件下照射7.3 min。将辐照后的树突状细胞（10⁴个/孔）和纯化的CD4+Tcells（10⁵个/孔）添加到96孔的U型底板中。5天后，收集上清液，使用AlphaLISA技术分析IFN-γ（PerkinElmer）。证实：双特异性诱导了自体CD4+ Tcell混合淋巴细胞反应（MLR）中IFN-γ的产生和人巨细胞病毒（CMVpp65）中的Tcell增殖。单药和联合给药相比，抗PD-1/GITR-L导致Teff（CD4⁺CD25^-）细胞增殖的百分比更高。此外，由于最佳的GITR交联，仅在抗PD-1/GITR-L的双抗组中观察到在没有Treg细胞的情况下Teff细胞的增殖。

最后研究了食蟹猴抗huPD-1-huGITR-L的交叉反应性。抗huPD-1-huGITR-L与细胞表面食蟹动物PD-1和GITR转染的细胞，与活化的细胞PBMCs和重组蛋白抗原结合，用抗huPD-1-huGITR-L处理食蟹猴PBMCs，可诱导HEK293 cynoGITR+报告细胞系的增殖和NFκB信号通路。所得结论支持利用食蟹猴作为鉴定抗huPD-1-huGITR-L PD生物标志物的相关物种。 

该双抗即独立于FcγR结合诱导最佳TNFR聚类的双特异性激动剂比单克隆抗体和TNFR配体更有效，且支持在小鼠中观察到的生物学转化为NHP和人源化系统的结论。如此看来，抗huPD-1-huGITR-L双特异性是一种前景极大的免疫治疗方法，通过优化聚类介导的抗原特异性T cells共刺激来克服PD-（L）1难治性患者的免疫逃逸。

来源于优宁维药物研发官网