新冠病毒的中和抗体是识别SARS-CoV-2的高度保守区域RBD表位，今天分享一篇发表在nature chemical biology的文章《Converting non-neutralizing SARS-CoV-2 antibodies into broad-spectrum inhibitors》。作者思路在于找出非RBD表位的非中和抗体（ReconnAbs），这类抗体可以有效的中和SARS-CoV-2及其变异株并且具有高活性，提出非中和抗体成为广谱抑制剂的一种可能性。
首先，作者从抗体库中筛选出48种非RBD表位结合的抗体，并使用流式荧光细胞分选技术（FACS），以SARS-CoV-1刺突蛋白作为抗原。通过ELISA证实了相应的全长IgG抗体同时与SARS-CoV-2和SARS-CoV-1刺突蛋白结合。通过生物层干涉技术（BLI）技术从10个克隆当中选出7个与SARS-CoV-1结合力强的克隆。其中一个克隆COV2-2449也能结合MERS和OC43刺突蛋白。没有克隆结合到NTD，与之前的报道一致，这些抗体是非中和性的。（如下图）
随后作者从上述7个单克隆抗体中通过BLI技术鉴定出5个独特表位，并选择了5个代表了不同表位的抗体开发scFv非中和抗体。作者设计足够长的连接子，使得ACE2同时结合RBD和scFv，并且不区分结合表位，均可以和spike S2结合。作者将scFv的C端连接到ACE2的N端，还在连接体中加入His标签和一个TEV蛋白酶位点，以便在其结合和抑制成分分离时评估ReconnAb的活性。使用凝胶电泳证实了TEV裂解可分离ACE2和scFv组分。随后研究ReconnAbs阻断ACE2与SARS-CoV-2 spike结合的能力，实验结果证明未被裂解的ReconnAbs可以有效的结合到Fc标签的ACE2蛋白，而TEV裂解的ReconnAbs没有结合。（如下图）
接下来，作者研究了ReconnAbs是否能够中和与SARS-CoV-2变异株对应的慢病毒假病毒，使用britelite荧光素酶报告基因法（PerkinElmer），用于病毒中和试验中感染的靶细胞来自稳定过表达SARS-CoV-2受体ACE2的HeLa细胞系，以及已知的处理SARS-CoV-2的蛋白酶TMPRSS2。ACE2/TMPRSS2/HeLa细胞在感染前1天进行铺板（96孔白色非底透），5000个细胞/孔。
在实验当天，纯化的CrossMAb-ACE2或scFv-ACE2在HEPES（20mM）和氯化钠（150mM）中，已有或未被TEV蛋白酶处理，无菌过滤。使用无菌1×DPBS稀释原液，每个稀释孔中含有30µl的CrossMAb-ACE2或scFv-ACE2。抑制剂孔包含30µl抑制剂稀释液和90µl的病毒混合物（病毒和D10培养基：DMEM+10%胎牛血清、L-谷氨酸、青霉素、链霉素和10mM HEPES）。病毒孔包含30µl 1×DPBS和90µl病毒混合物。细胞孔，包含30µl 1×DPBS和90µl D10培养基。抑制剂与病毒在37°C下孵育1小时。取100µl加入细胞中（培养基已移出）在37°C下孵育感染24小时后，在含有TEV酶连接子的样品中，更换新鲜培养基，没有裂解；没有TEV酶连接子的样品不换培养基。48小时后每孔等体积加入britelite荧光素酶底物（PerkinElmer）。结果发现所有的ReconnAbs都中和作用，其中一些对奥密克戎中和较强。COV2-2143-ACE2对ReconnAbs的中和作用较弱。
COV2-2449-ACE2在变异株间的中和能力偏差最小，与其表位是最保守的相一致。此外，在活病毒检测中，CV10、CV27和COV2-2449对武汉-1和奥密克戎SARS-CoV-2病毒表现出中和作用。然而，TEV裂解的ReconnAb为呈现相同的中和能力，这表明连接子对于ReconnAb成分协同工作是必不可少。
为了探究连接子长度是否足以赋予所需的活性，作者研究了两个不同表位的两个scFv-ACE2更长的连接子长度，CV27-ACE2和COVA2-14-ACE2。结果并未出现活性增加的迹象，这表明所检测的连接子长度足以赋予所需的活性。（如下图）
综上所述，本文所描述的结果为ReconnaAbs作为一类新型的广泛中和疗法的发展奠定了基础。
可以设想，对保守的、非中和性的抗体也可以进行改进。SARS-CoV-2非RBD抗体文库来源于COVID-19大流行早期的序列，其范围相对较小。例如，该文库不包含任何疫苗衍生抗体，已知包括交叉反应、非中和性抗体。未来迭代或从更大的文库着手，可能选择针对最高度保守的表位和最不可能发生突变逃逸的抗体和/或纳米抗体。虽然关注的是非中和抗体，但与保守表位结合的中和抗体也可能作为ReconnAbs的保守成分。
SARS-CoV-2病毒进化通过突变中和表位来应对免疫压力，奥密克戎变异株证实了这一点。与中和性表位相比，高度保守的、非中和性表位在理论上不太可能受到免疫压力的影响，因为在这些位点上的抗体结合并不影响病毒感染细胞的能力。所以认为ReconnAbs是目前的SARS-CoV-2治疗更可行的长期选择。
来源于优宁维药物研发官网
