有机酸作为一种重要的化学品原料，被广泛的应用于生物医药、食品添加剂和材料化学等行业。近年来，利用微生物发酵法生产有机酸成为一种很有前景的生产方法。然而，在微生物发酵有机酸的生产过程中，因其代谢途径机理的关系导致发酵液的pH不断下降（通常低于3.0），从而影响了细胞的代谢活性和生产效率。目前，工业化生产有机酸的主要方法是通过在生产过程中添加大量中和剂（如CaCO3、MgCO3、NaOH或NH3H2O等），这不仅增加了下游分离纯化工艺的难度，提高了生产成本，还会给环境造成严重的污染。因此，如何选育可耐受低pH (<3.0) 的微生物进而实现无(或少)中和剂的添加是长期以来有机酸发酵工业亟需解决的一个关键难题和挑战。

图1 L-苹果酸的生产（传统生产法&无中和剂生产法）

最近江南大学未来食品科学中心和生物工程学院陈坚院士团队的刘龙教授课题组发表了最新的研究成果“Highly efficient neutralizer-free L -malic acid production using engineered Saccharomyces cerevisiae”。该研究以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为出发菌株，选育了一株可耐受低pH(pH<3)的酿酒酵母突变株TAMC (图2)。通过团队技术人员进一步的对菌株基因改造调控，该菌株在3L发酵罐（迪必尔生物有限公司）上，在不添加任何中和剂的条件下进行了补料批次培养，发酵144h，L-苹果酸的产量达到了232.9 g/L (目前报道的苹果酸最高产量)，转化率为0.66 g/g葡萄糖，生产强度为1.62 g/L/h。

（1）耐酸酿酒酵母的筛选       

该研究以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为出发菌株，首先以L-苹果酸和柠檬酸为选择压力，通过近1800代实验室适应性进化与筛选，选育了一株可耐受pH 2.3的酿酒酵母突变株TAMC 。

图2 耐酸酿酒酵母的筛选

（2）菌株基因重构

   以耐酸酿酒酵母TAMC为底盘细胞，通过代谢途径重构、转运体工程等策略，实现了L-苹果酸的高效合成。

图3 TAMC菌株L-苹果酸胞质合成途径的代谢调控

图4 L-苹果酸转运体的调控与改造

图5 转运蛋白SpMael 和SpMael突变体的结构预测与分析

（3）生物反应器上放大培养       

该团队研究人员在迪必尔生物工程（上海）有限公司3L发酵罐上进行了进一步的放大培养。控制参数条件如下：初始装液量1.1L，转速700-800 rpm，通气量1.5 vvm，培养温度30℃，初始葡萄糖浓度60 g/L，补料葡萄糖浓度为600 g/L。做两个不同条件的pH控制方式处理，其中一个处理不添加任何中和剂，pH不控；另一个处理添加中和剂控制pH在6.5。结果发现，本课题改造后的工程酿酒酵母菌在L-苹果酸的生产中可耐受低pH,产物产量不受低pH的影响，所以L-苹果酸生产过程中可不添加任何中和剂。

表1 L-苹果酸在3L生物反应器上不同工艺条件下的发酵结果

图6  L-苹果酸在3L生物反应器上的生产曲线  

(A 过表达PYK或者CYB2基因菌株的L-苹果酸和L-乳酸的产量；B 在3L反应器上不添加中和剂的L-苹果酸生产曲线；C 在3L反应器上添加中和剂维持恒定pH 6.5的L-苹果酸生产曲线)

文献中使用的3L发酵罐来源于迪必尔最经典的Intelli-Ferm系列。硬朗的工业化不锈钢机身设计，罐体体积从3L到15L，广泛适用于各种微生物发酵场景。Intelli-Ferm系列生物反应器分为单罐(T&J Intelli-Ferm A)，双联罐(T&J Intelli-Ferm B)和多联罐(T&J Intelli-Ferm Q)三种规格，可加载D2MS、尾气分析、葡萄糖在线检测、罐体称重及补料称重等多种功能模块，灵活满足不同工艺控制策略。