自 1986 年 FDA 批准第一种重组蛋白以来，多年来批准的生物制药的数量不断增长，这反映了它们在现代医学中的重要性^[1]。到 2021，FDA 批准了 100 个单克隆抗体产品^[2]以及其他 9 种新的生物药物，占当年批准药物总数的 16%^[3]。生物制药市场 35 年的稳定增长模式反映了这些药物是治疗多种疾病最有效的临床治疗方式之一；因此，几乎所有医学分支都越来越多地使用它们^[4]。

生物治疗是一种尖端药物，其靶向人体中特定的分子，这些分子参与广泛传播的疾病（包括癌症、免疫和代谢紊乱）^[5]。哺乳动物细胞系，如中国仓鼠卵巢细胞（CHO）和人类胚胎肾 293 细胞（HEK 293），是用于生产重组DNA（rDNA）来源的人类治疗蛋白的最常见平台。这些细胞系被设计为携带编码所需蛋白质的基因，是生物技术公司拥有的最重要资产。因此，公司需要确保这些产品的安全性、纯度和性能，并限制生产过程中的可变性，以确保最终产品的一致性。

可能影响工艺一致性和产品质量的一个主要因素是细胞系的克隆来源或单克隆性^[6]。

“简而言之，单克隆性基本上是从单个细胞开始的细胞系，”Advanced Instruments 高级业务拓展经理 Andrea Gough 解释道无论您想要制造重组抗体、病毒载体、疫苗还是诱导多能干细胞（iPSC），建议从同质的单克隆来源的生产细胞系开始，以降低过程可变性和患者的潜在风险。”

特征良好的单克隆衍生细胞系不仅是生物制药生产过程的基本组成部分，也是向监管申报的要求，最典型的是在研究新药（IND）申报阶段。事实上，单克隆衍生可以影响产品的关键质量属性^[7]。因此，生产细胞系的单克隆性的证明至关重要，并且应在细胞系开发期间尽早确认。Gough 继续说道：“多个监管机构越来越严格，需要更详细的 MCB 单克隆性证据。”“因此，公司的目标是在开发过程的早期就开始对细胞系做单克隆，并尽快获取所需的证据。”事实上，作为总体控制策略的一部分，监管机构要求所有生物生产细胞系“从单个细胞的起源细胞开始克隆”，以确保安全性和产品质量一致性^[8]。美国（FDA）和欧盟（EMA）在生产细胞系的单克隆来源方面对生物治疗药物的生产有不同也有类似的指导方针（见表1）。

表1

Gough 表示：“单克隆性的重要性与产品的稳定表达有关，如果药物批准后出现任何供应问题，患者可能面临风险。因此，监管要求中强调了这一点。” “尽管 CHO 细胞系被认为是一种非常强健的细胞系，自 20 世纪 80 年代以来一直被用于生物治疗药物的生产，但其基因组是相当‘可塑性’的，可以随时间变化的，因此从单个 CHO 细胞开始可以帮助降低风险。”事实上，这种不稳定性和染色体异质性会影响细胞生长、产率和产品质量^[13]。

单克隆性确证降低了异质细胞群体变化的可能性，从而降低了供应问题的风险，最终也降低影响患者健康的风险。Gough 解释道：“对生物技术/制药公司来说，最糟糕的情况是药物上市后出现生产问题。” “如果公司无法供应药物，这可能会对等待治疗的患者产生重大后果。将对患者健康的风险降至最低也是监管机构的重要考虑因素。”

为了产生单克隆衍生的细胞系，需要分离、培养和扩增单个前体细胞。传统的方法执行这一亚克隆步骤是有限稀释（LD），这是在 20 世纪 80 年代初开发的，用于克隆单克隆抗体生产中的杂交瘤细胞系^[14]。Gough 解释道：“有限稀释是指将细胞在细胞培养基中大量稀释至理论浓度为 0.5 个细胞/孔，然后再进行铺板和扩增。” “这种方法是基于概率的：你希望每个孔的细胞浓度如此之低的原因是为了避免有许多孔含有两个细胞或没有细胞。如果你从一个更高的目标浓度开始，例如每个孔一个细胞。”事实上，LD 依赖于一种概率方法，该方法提供了相对较高的所产生细胞系单克隆衍生的统计概率，特别是在进行第二轮克隆时（见表 2）。此外，显微评估可用于目视确认孔中是否存在单个细胞。尽管这是一种相对廉价的工艺，但 LD 劳动密集、耗时、速度慢且产量低；科学家之间的差异也很大，显微镜观察也没有报告。此外，潜在的统计考虑是基于用珠子而不是细胞进行的研究，没有考虑到细胞不像珠子那样的行为，因为它们往往粘在一起。因此，即使进行双轮克隆，也可能无法完全保证基因同源性。

来源于优宁维药物研发官网