嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗是适应性免疫治疗的前沿。CAR-T细胞是由T细胞设计而来的，通过促进癌细胞表面的相互作用来特异性地靶向肿瘤细胞。CAR-T细胞的激活导致了由CAR-T细胞产生的细胞因子和趋化因子产生的细胞信号通路的增加，以破坏靶向肿瘤细胞。这篇综述旨在展示使用不同类型的检测方法来检测CAR-T或T细胞活化和杀伤靶肿瘤细胞的效果。
CD19特异性CAR-T治疗，Kymriah®和Yescarta®分别治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）和非霍奇金淋巴瘤，为临床中具有更多CAR-T靶点的其他CAR-T治疗打开了大门。到目前为止，主要成功的药物是靶向血液恶性肿瘤。它比实体肿瘤更容易靶向，而实体肿瘤由于免疫抑制微环境而具有更高的屏障（Wang et al.）。
CAR-T设计包括一个抗原结合位点、铰链和间隔区，以及细胞内激活域。第一代表达一个T细胞内激活信号域（CD3ζ），而第三代现在通常表达共刺激域（CD28，或4-1BB）（Androulla和Lefkothea）。
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CAR-T细胞活化
当CAR-T细胞识别肿瘤抗原并与肿瘤细胞结合时，细胞因子、穿孔素和颗粒酶的释放，会导致肿瘤细胞和周围间质中的细胞死亡（Benmebrarek et al.）。这些细胞因子可包括IFNγ、TNFα、IL-2和IL-8。在模拟CAR-T治疗的共培养体外模型系统中，可以在细胞上清液检测到。
Von Scheidt等使用AlphaLISA检测了在存在双特异性cMyc/CD40抗体的共培养环境下，CAR-T细胞产生的IFNγ。cMyc标签仅存在于CAR-T细胞中，CD40在抗原提呈细胞（APCs）上表达，包括树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和B细胞的亚群。在CD40+APCs通过流式细胞术和IFNγ释放来检测CAR-T细胞增殖，其对照组为未转导CAR分子的仅包含c-myc tagged anti-HER2。
Copyright: von Scheidt, B. et al. Enterotoxins can support CAR T cells against solid tumors. PNAS 116:50 (2019). Figure reproduced with permissions granted by PNAS.
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CAR-T杀伤功能检测
除了使用细胞因子的释放来测量CAR-T细胞的活性外，对靶向肿瘤细胞群中特异性细胞裂解的检测也显示了CAR-T细胞的杀伤活性。DELFIA EuTDA细胞毒性试剂安全、快速的用BATDA试剂标记靶细胞，一旦进入细胞，内酯酶裂解BATDA底物形成TDA，不能再穿过细胞膜屏障。标记靶细胞的裂解释放上清液中的TDA，然后将其转移到检测板上，并与铕溶液结合生成荧光分子EuTDA。信号与靶细胞的死亡呈现正相关。
Du S-H等使用DELFIA EuTDA细胞毒性试剂、Raji和Daudi细胞，比较了多种抗CD19 CAR分子的CAR-T细胞的杀伤功能。如下图，相对于对照组Mock和GFP CAR-Ts，几乎所有CAR分子均使得杀伤率显著增加。证明了将CAR-T添加到T细胞亚群和提高细胞杀伤能力是有效的。
Copyright: Du S-H, Li Z, Chen C, Tan W-K, Chi Z, Kwang TW, et al. (2016) Co-Expansion of Cytokine-Induced Killer Cells and Vγ9Vδ2 T Cells for CAR T Cell Therapy. PLoS ONE 11(9): e0161820.
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