基因治疗中使用的两种最常见的核酸有效载体是信使RNA (mRNA)和质粒DNA (pDNA)。质粒DNA (pDNA)是病毒载体生产的基本组成部分，它被用来编码病毒颗粒的生产，也被线性化为mRNA产物提供模板。
质粒DNA (pDNA)是在细菌中发现的小的环状双链DNA分子，与基因组中提取的DNA不同，它能单独复制。采用重组DNA方法将基因剪接到质粒中，质粒随后复制剪接的基因，包括开环(oc) pDNA和超螺旋(sc) pDNA。由于稳定性和抗原性的要求，sc亚型是DNA疫苗接种和基因治疗的选择，因此，开发从ocDNA中分离scDNA的纯化方法是很重要的。
在DNA纯化中同时使用疏水作用色谱（HIC）和离子交换色谱（IEX）的方法在文献中有很多案例分享。Astrea生物二步法分离pDNA的组合包括以专利琼脂糖基质PuraBead®作为基架的HIC 填料（苯基、丁基、己基和辛基）和IEX填料（Q、DEAE、SP 和 CM）。本文详细介绍了IEX色谱法和HIC色谱法对pDNA的纯化方案。
DEAE PuraBead HF用于pDNA初级捕获步骤，己基PuraBead®® 6HF用于以 1 mL 和 8 mL 柱分步洗脱分离 scDNA 和 ocDNA。
材料和方法
使用DEAE PuraBead® HF RoboColumns®对pDNA原料进行了捕获。
15 g大肠杆菌表达的pDNA (6.8 Kb序列编码抗cd19抗体) 通过碱性裂解和RNAse处理去除RNA。将上清液 交换到四种不同条件下 (0、0.1、0.2或0.3 M氯化钠的EQ缓冲液)并一式四份加载到 16 x RoboColumn®200 μL DEAE PuraBead® HF柱上。
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EQbuffer：50 mM Tris pH 7.2 10 mM EDTA，含有 0、0.1、0.2 或 0.3 M 氯化钠
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50 mM Tris pH 7.2 10 mM EDTA 600 mM 氯化钠洗脱
使用BioMek自动处理系统，停留时间为1.1分钟。
洗脱馏分被脱盐并收集用于后续的pDNA纯化。
使用DEAE PuraBead HF 5mL预装柱对pDNA进行初级捕获
将22 mL大肠杆菌裂解物交换到50 mM Tris pH 7.2， 10 mM EDTA中的缓冲液中，然后加载到5mL DEAE HF预装柱上。
色谱柱载量924 μg pDNA/mL填料，总载量为4.32 mg pDNA。
缓冲区
上样：50 mM Tris pH 7.2，10 mM EDTA
洗脱：50 mM Tris pH 7.2 ，10 mM EDTA 600 mM 氯化钠 原位清洁：0.5 M 氢氧化钠
使用 Hexyl PuraBead® HF 分离 scDNA 和 ocDNA – 1 mL 色谱柱
Hexyl PuraBead® 6HF用于从ocDNA中分离出scDNA，目的是结合所有的pDNA，并在洗脱过程中分离出scDNA峰。
第一个实验用直径为0.5 cm的1 mL Hexyl PuraBead® HF色谱柱。
使用2 M硫酸铵（缓冲液A：50 mM Tris，5 mM EDTA，2 M硫酸铵 pH 8.0）平衡
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在缓冲液 A 中的总上样量为4.7Kb 0.23 mg gWiz pDNA ，停留时间为 5 分钟。
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使用缓冲液B（50 mM Tris，5 mM EDTA pH 8.0）的100%梯度洗脱pDNA。
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使用0.5 M NaOH，30%异丙醇的CIP。
收集两个峰，脱盐并进行1%琼脂糖凝胶电泳。
使用 Hexyl PuraBead® HF–8 mL SNAP® 色谱柱分离 scDNA 和 ocDNA
将Hexyl PuraBead® HF填充在直径为1 cm，柱床高为10 cm的SNAP®色谱柱（8 mL色谱柱）中。
使用的缓冲液如下：
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平衡缓冲液：50 mM Tris、5 mM EDTA、pH 8.0、2 M硫酸铵
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洗脱缓冲液：50 mM Tris，5 mM EDTA pH 8.0
色谱柱上样0.88 mg gWiz 4.7Kb的pDNA，在平衡缓冲液中停留时间为5 min，然后洗脱，通过洗脱峰收集馏分。使用0.5 M氢氧化钠，30%异丙醇进行CIP。
洗脱馏分被脱盐，汇集，并进行1%琼脂糖凝胶电泳
来源于优宁维药物研发官网
