宿主细胞蛋白(HCP)抗体性能的可靠性评估具有挑战性。

本案例研究介绍了用于定量中国仓鼠卵巢产生细胞系(CHO)过程相关杂质的HCP ELISA抗体的开发和特性。选择适合HCP ELISA的捕获抗体混合物不仅取决于其酶联免疫吸附特性，还取决于抗体覆盖范围。覆盖范围通常由2D Western blotting (2D WB)确定。然而，基于2D WB的覆盖率结果强烈依赖于所使用分析的方法/技术细节。2D WB分析的信息价值可能进一步受到变性分析条件的限制，从而可能低估覆盖范围。为了在几乎原生的检测条件下(类似于ELISA)对免疫试剂进行全面可靠的表征，还可以使用免疫亲和色谱(IAC)和2D差异凝胶电泳(2D DIGE)进行正交覆盖评估。

在本研究中，对 HCP 群体进行了分化，并将其用于个体免疫接种，以提高对免疫原性较弱的低分子量（LMW）HCP 的免疫反应。在 ELISA、2D WB 和 IAC/ 2D DIGE 中测试了由此产生的捕获抗体混合物的反应性。结果表明，不同的抗体组成和所用的分析方法会产生明显的差异。

采用合适的工艺相关模拟物作为抗原，通过兔免疫制备CHO - HCP特异性抗血清。一组用未分离的total HCP免疫，该total HCP代表了各自模拟细胞系中几乎所有蛋白质的混合物。另一组用相应的主要含有小蛋白(＜50 kDa)的LMW HCP进行免疫。制备不同的小规模抗血清试验池，并进行亲和层析，得到一组纯化的抗体混合物(Table 1)，并在ELISA中通过2D Western Blotting和IAC/ 2D DIGE进行比较。ELISA检测时，分别与生物素偶联制备相应的检测抗体。

抗体混合物(Table 1)通过ELISA检测，因为这是HCP定量的最常用方法。

为了定量，样品测量根据标准曲线进行，该标准曲线由与工艺相关的不同预定义浓度的HCP组成。通过相应的生物素偶联检测抗体与链霉亲和素偶联过氧化物酶和比色底物结合进行检测。

将不同的抗体混合物应用于Total HCP(Figure 1)及其同源抗原混合物80T:20L或50T:50L(Figure 2)作为检测标准，得到了可比性的HCP标准曲线。

以Total HCP材料为检测标准时，原料药中HCP浓度在HCP Antibody T+L (3.3 ppm)、HCP Antibody 80T:20L (7.1 ppm)和HCP Antibody 50T:50L (11.2 ppm)之间明显升高。相比之下，当使用其同源抗原混合物时，两种T:L混合物(8.7 ppm和10.3 ppm)的HCP水平相当，表明绝对标准曲线反应性不会影响ELISA结果，而特定抗体组成明显影响检测灵敏度(Table 2)。比较标准曲线分析进一步支持了这一点(Figure 2)。

采用两种正交方法评估HCP抗体覆盖率:

1.对于荧光2D WB分析，在2D电泳之前对总HCP样品进行荧光最小标记。通过印迹膜的荧光扫描可视化总蛋白模式。在同一膜上进行HCP特异性免疫染色，涉及合适的荧光标记二抗。以HCP抗体T+L（Figure 3）和HCP抗体50T：50L（Figure 4）为例，给出了2D WB分析的结果。

基于荧光2D WB的覆盖率测定显示，大多数高分子量(MW)蛋白质的覆盖率成功检测，而中低分子量蛋白质的覆盖率似乎非常有限。

由于Western blot方法的变性分析条件和低分子量范围内较低的整体免疫原性，HCP抗体的表现通常被低估。

2. 应用IAC/2D解决了与方法相关的低估，DIGE作为正交法评价HCP抗体覆盖性能。将不同的HCP抗体固定在亲和柱上，用Total HCP孵育。提取结合HCP并与原始总HCP样品进行2D DIGE对比分析。HCP抗体T+L和HCP的检测结果抗体50T:50L(Figure 5)为例。

在分析Total HCP样本和各自的IAC提取物时，2D DIGE从定性的角度显示了高度可比性的HCP模式。结果表明，测试的抗体成功地覆盖了total HCP样本中广泛的HCP谱。

荧光2D WB和IAC/2D DIGE数据集的详细评估使用Delta 2D分析软件。综合结果如Table 3所示。

数据评估证实了目视数据检查的结果，并揭示了由于每种分析方法的特定优点和缺点，两种正交策略确定的覆盖率值之间存在相当大的差异。

基于该比较研究的结果，HCP抗体50T：50L被选择用于最终的HCP ELISA开发，包括total HCP作为测定标准品，原因如下：