腺相关病毒 (AAVs) 于 20 世纪 60 年代中期被研究者发现，近年来已成为基因治疗的主要载体。它具有许多理想属性：安全性好、免疫原性低、能感染分裂细胞和非分裂细胞、能介导基因长期稳定表达等1。尽管目前已有两款 FDA 批准的基于 AAV 递送技术的基因治疗产品，取得了重大临床和商业成功，但病毒载体的成本效益仍然是一个挑战。本文主要介绍了 AAV 市场需求、下游生产路线、AAV 稳定性及降解途径，为提高 AAV 生产效率提供思路。
病毒载体的市场趋势及需求
在过去几年中，AAV 基因疗法商业化成功案例大大增加了国内外细胞和基因疗法的热度。在全球范围内，有超过 2,400 项 CGT 临床试验正在进行中2。由于 CGT 的开发时间比传统生物药更短，并且可以遵循加速的监管审批途径，因此 CGT 和 RNA 治疗市场持续扩大。自 2021 年 Q1 以来，仅基因治疗管线就增长了 16%，从临床前到注册前阶段，有 3,579 种 CGT 和 RNA 疗法正在开发中2。不断增长的市场需求要求生产技术迅速发展，以及病毒载体基因疗法应用不断扩大，如应用于更常见的疾病，及提高病毒产量、降低成本。
图1. 5 年内病毒载体的 CDMO 需求预测
2022 年 2 月的 ISR 调查报告显示，大约 25% 的生物制药或小分子企业没有 CGT 生产能力，对病毒载体的外包需求较高。62% 的公司通过 CDMO 增强其病毒载体生产能力，预计未来五年这一需求将保持稳定，到 2026 年略微上升至 68%（图 1）。正在开发中的基因疗法中，有 89% 的项目使用病毒载体递送，其中 AAV 和 LV 载体是最常用的（图 2）。病毒载体生产在整个行业中并未标准化，创建一个标准化工艺平台可以最大限度地减少开发工作和复杂性，有助于加速临床产品的 GMP 生产。
图2. 用于临床开发的病毒载体类型
AAV 下游关键挑战和层析工艺方法
图3. AAV病毒载体生产工艺流程
AAV 病毒载体的生产是一个复杂的过程（图 3），需要创新的方法来满足安全性和有效性要求、临床和市场需求以及商品成本目标。制备稳定的病毒载体，防止其在生产、储存过程中降解，保持其长期稳定性和功效是 AAV 生产者面临的主要挑战。
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AAV 下游工艺流程
下游工艺包括从工艺和产品相关杂质中纯化病毒颗粒，去除宿主细胞、质粒 DNA 和空壳病毒等杂质。近年来，已经开发出了纯化 AAV 载体的步骤，但下游工艺占病毒生产总成本的很大一部分，因此需要更具有成本效益地生产 AAV，采用一种有效且可重复的方法来生成高纯度的病毒载体。
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AAV 下游关键挑战
主要挑战在于细胞裂解、过滤、层析，这些步骤通常缺乏高效且通用型的方法。
a) 细胞裂解：从细胞中释放 AAV 载体的基本技术是重复冷冻/解冻，然后低速离心，然而该技术不适合大规模纯化。机械匀浆使用高剪切力导致膜破裂，尽管可放大，但由于剪切力引起的聚集和沉淀，经常导致产品损失。Triton X-100 作为裂解去垢剂能提供足够产量，然而研究表明 Triton X-100 会产生毒性，并于 2016 年 12 月被欧洲化学品管理局列为高度关注物质 (SVHC)3 。因此，需要一种替代的细胞裂解方法，不仅能够充分裂解细胞，还可以保护 AAV 在纯化过程中免受压力。
b) 过滤：过滤是 AAV 下游工艺中最昂贵的操作步骤，它可能导致 AAV 颗粒聚集或由于过滤过程中的剪切力而失活。细胞裂解产生大量细胞碎片，难以通过滤器，优化滤器以实现高通量回收仍然是一个挑战，它还取决于 AAV 血清型。连续过滤作为一种分离技术可能会减少过滤器堵塞，但实际应用还不多。由于基因治疗产品缺乏合适尺寸的滤器，过滤过程中滞留量大和产品损失也是一个问题。
c)层析方法：典型的层析方法包括亲和层析、离子交换色层析。虽然亲和层析能够产生高产量的 AAV，但它无法区分空壳和完整衣壳。层析的挑战之一是每种 AAV 血清型都需要特定亚型的纯化方法，需要一种实现最佳产量，同时保持产品效力和完整性的层析方法。此外需要各个阶段尽量减少衣壳蛋白的物理和化学降解（如聚集、蛋白水解、氧化和脱酰胺），以免影响病毒感染效率。
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AAV 下游平台工艺方法
目前最主流的 AAV 层析方案采用两步工艺：
图4. AAV两步法层析流程
第一步：亲和层析从细胞裂解物中捕获 AAV 病毒
POROS CaptureSelect 系列亲和填料具有广泛的选择性、高载量和洗脱回收率(单步即可获得 >90% 的回收率和 90% 的纯度) ，以及良好的可放大性(图 5) ，POROS CaptureSelect 系列亲和填料优势如下：
a) 通用性广，适用于多种 AAV 亚型的纯化，捕获 AAV 能力强
b) POROS基架具有较大的流穿内孔，可快速纯化大量细胞裂解液
c) 填料可在不同流速下使用，不影响载量、分辨率和纯度，极大增加了工艺设计灵活性
图5. POROS CaptureSelect AAVX 捕获 AAV8（左）和 AAV2（右）的产率
第二步：使用 POROS HQ 填料进行空壳和实心病毒分离
将 AAV 样品上样在 POROS HQ 柱上，然后使用醋酸钠线性梯度洗脱。以 A280 吸收特征峰的空衣壳，比 A260 吸收特征峰的实心病毒洗脱更快。空壳和实心病毒以 16:1 的比例混合后，又在相同的梯度条件下使用 HQ 层析柱纯化，首先出现空壳峰，然后出现基线分离的实心峰，展示了填料的高分辨能力，为 AAV 空衣壳的去除提供了一种可行且可扩展的工艺。（图 6）
图6. POROS HQ 分离 AAV 空壳和实心病毒颗粒
AAV 的稳定性及降解途径
AAV 降解可分为两大类：物理途径和化学途径。病毒载体的降解取决于溶液条件，特别是 pH 值、离子强度和原料污染物，以及温度、剪切力、冻融和光照等外部因素。
1.AAV 载体会通过变性/展开、聚集、表面吸附这三种物理途径发生降解，引起高阶结构的变化。物理不稳定性会对产物稳定性和转导效率产生不利影响，如果降解产物由于其非天然结构而具有毒性或免疫原性，则 AAV 制剂的安全性也会受到损害4。
2.AAV 载体也会通过二硫醚交换、脱酰胺、氧化和脱落等化学修饰途径，产生新的结构，影响载体的安全性和有效性。化学降解通常会改变蛋白质的物理性质，例如静电、疏水性、二级和/或三级结构，以及热力学和动力学展开/折叠屏障5。
病毒载体的稳定性和临床性能可以通过化学修饰来改变。例如，用丙氨酸或精氨酸对 AAV2 衣壳中的丝氨酸、苏氨酸和赖氨酸残基进行突变已证明可以提高转导效率6。将叠氮化物部分引入 AAV 衣壳蛋白中，然后通过正交和化学计量缀合多种化合物，通过点击化学添加聚乙二醇 (PEG) 已证明可将混合人血清中的稳定性提高 1.7 至 2.4 倍，并且抗体识别能力降低近两倍7。在中和抗体存在的情况下，与 PEG 2000 缀合的 rAAV2 在 1000:1 的比例下显示转导效率增加 2.3 倍8。
小结
本文主要讨论了 AAV 的下游生产路线、AAV 稳定性及降解机理，并为提高 AAV 生产效率提供思路。采用亲和捕获和阴离子精纯两步方案，建立一个简化和可放大的 AAV 层析过程，获得高纯度的 AAV 产品。相信随着行业经验的增长和平台方法的不断开发，AAV 下游工艺会变得更加高效、标准化。
来源于优宁维药物研发官网
