AAVs 或adeno-associated viruses是细小病毒科的小单链DNA病毒，已成为基因治疗的主流病毒载体。AAVs最初是作为腺病毒制剂的污染物被发现的。由于其插入突变的风险低和已证实的成功临床案例，它们现在已成为基因治疗基因传递的主要载体。近些年在开发AAV衣壳和优化基因组有效载荷方面的进展，极大地促进了基因治疗载体的发展。

AAV2是最广泛用于基因传递的AAV血清型。然而，还有许多其他AAV血清型。其中包括AAV5, AAV8和AAV9已用于病毒载体基因治疗临床试验。随着基因治疗技术的不断进步，越来越多的公司进入市场，对重组或rAAV作为平台技术基础的需求越来越大。

AAV纯化通常需要使用生物工艺树脂，基于亲和吸附的方法是许多工艺流程中既定的色谱步骤。这些树脂基于camelid配体技术与衣壳表面的不同结合位点相互作用。亲和配体在一系列血清型中具有广泛的适用性，但其也有缺点，例如：与苛性碱溶液不相容，倾向于与AD5共洗脱以及价格高昂。此外，有些AAV突变体对基于蛋白质的亲和柱亲和力较差。

从原料中捕获AAV后，必须分离空衣壳和完整的衣壳。在在某些情况下，使用铯梯度的超速离心，但这不能满足工艺放大的需求。

为了满足病毒载体基因治疗公司不断增长的需求，Astrea Bioseparations开发了一个完整的纯化解决方案，应用先进的配体技术和专利的PuraBead®琼脂糖基质。利用我们成熟的树脂技术，开发出完全可放大、血清型通用和可重复使用的工艺流程。

Astrea生物分离纯化工作流程的第一步是初级捕获。为此，选择我们的SP PuraBead®P6HF用于纯化AAV8和AAV9血清型为例。色谱柱初始装载9.4 E12的AAV8和1.14 E13的AAV9。

在柱上保留时间3.3分钟后，用0.4 M NaCl (AAV8)或0.5 M NaCl (AAV9)洗脱柱上残留的AAVs。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定不同组分中AAV颗粒的含量。洗脱后，我们能够获得70-80%的AAV衣壳回收率，通过感染性实验测量其功能，并可以交换到中性储存溶液中进行进一步处理。

与所有捕获步骤一样，使用SP PuraBead®P6HF捕获AAV衣壳可以去除包括HCPs和HCDNA在内的大量杂质。然而，在分离空衣壳和完整衣壳之前，它仍需要进一步的纯化。在分离步骤之前以流穿方式去除杂质可以提高最终分离的效率，并且必须在分离步骤之前进行配制或稀释。

为了去除这些杂质，可以选择HCPure宿主细胞蛋白清除树脂，因为它具有混合模式和多种结合相互作用，能够尽可能多的去除杂质。

由于AAV2在配制和过滤过程中可能出现产品损失，纯化具有挑战性，因此我们选择了AAV2来测试HCPure的去除杂质效果在这一步中，AAV2血清型用市售的亲和树脂纯化，但仍保留了大量的低分子量蛋白。

HCPure是在流穿模式下使用的，初次捕获的样品不需要用溶液置换，可以直接过柱，极大程度节省时间和物料（缓冲液）。进行初始柱运行以确定AAV2中间体的量，该中间体可以装载到8ml柱上。SDS-PAGE分析通过馏分的流动(图3)表明，低分子量的杂质蛋白在第一个2.5 mL馏分后开始流出。

将含有杂质蛋白的HCPure馏分汇集并通过载量为2.5 mL的HCPure柱重新处理。将流穿馏分和PLW收集为2 mL馏分。在SDS-PAGE上运行柱运行的5个流动体积，如图4所示。前2个Flowthrough馏分具有优异的纯度，可以汇集在一起去除复杂的杂质蛋白，而AAV2的损失很小，可以进一步优化以尽量减少任何损失。

在获得可用于基因治疗的功能性AAV之前的最后一步是分离空衣壳和完整衣壳。如果没有这一重要步骤，治疗的效力和有效性就会降低。

使用我们的Q PuraBead®P6HF吸附剂分离空壳。含有5.9 E 13 AAV 8/ mL吸附剂的样品在BTP pH 9中以低电导率加载到含有Q PuraBead®的柱上，并使用线性梯度洗脱至250 mM NaOAc。利用该方法，富集的AAV8完整衣壳可回收70%。