PART 03

常见研究转录因子的方法

01.DNA与蛋白相互作用研究

• DNA结合结构域：负责与特定的DNA序列相结合，常见的结构模体有锌指结构、螺旋-转角-螺旋结构、亮氨酸拉链结构等。不同的结构模体决定了转录因子与DNA结合的特异性。

• 转录激活结构域：与其他转录相关蛋白相互作用，促进或抑制转录的起始。

• 蛋白质-蛋白质相互作用结构域：介导转录因子与其他蛋白质之间的相互作用，形成转录调控复合物。

（1）凝胶迁移实验（EMSA）体外实验

将标记的DNA探针与细胞提取物（含有转录因子）混合，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。若转录因子与DNA探针结合，会使DNA-蛋白质复合物的迁移速度变慢，在凝胶上形成滞后条带，以此证明转录因子与特定DNA序列的结合。

凝胶迁移实验（EMSA）示意图

（2）染色质免疫沉淀技术（ChIP）

在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，然后破碎细胞，超声处理将染色质打断成小片段，用特异性抗体免疫沉淀与转录因子结合的DNA片段，再通过PCR或测序技术鉴定与转录因子结合的基因组区域，确定其在基因组上的结合位点。

染色质免疫沉淀技术（ChIP）示意图

（3）DNA亲和纯化测序（DAP-seq）

DAP-seq（DNA亲和纯化测序）是类ChIP-seq的体外实验技术，它通过体外蛋白表达技术，将带有标签的转录因子（TF）与基因组DNA文库在体外结合，分离出结合的DNA后进行高通量测序，从而精准定位TF的结合位点。该技术突破性地将体内结合实验转移至体外，彻底解决了ChIP抗体制备的难题，极大提升了DNA结合位点的发现效率。其优势在于不仅能超高通量查找TFBS（转录因子结合位点），还能深入解析众多TF的生物学特性与结合位点结构，在各类有机体的顺反调控和表观研究中展现出重要价值。

DNA亲和纯化测序（DAP-seq）示意图

（4）酵母单杂交系统

将转录因子的编码基因与酵母的报告基因融合，构建诱饵载体，同时将含有潜在结合位点的DNA片段克隆到报告基因的上游。如果转录因子能与该DNA片段结合，就会激活报告基因的表达，通过检测报告基因的活性来判断转录因子与DNA的相互作用。

酵母单杂交系统示意图

02.转录因子功能验证

（1）基因过表达和RNA干扰技术

1）基因过表达

构建转录因子的过表达载体，通过转染技术将其导入细胞中，使转录因子在细胞内过量表达。随后，观察细胞在表型上的变化，如细胞增殖速率、分化方向、凋亡情况等。通过分析这些变化，能够了解转录因子在细胞生理过程中的功能。例如，过表达某转录因子后，若细胞的增殖速度明显加快，说明该转录因子可能在细胞增殖调控中发挥促进作用。 

2）RNA干扰技术

利用RNA干扰（RNAi）原理，设计针对转录因子mRNA的小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）。将这些RNA分子导入细胞后，它们会特异性地结合转录因子的mRNA，促使其降解，从而抑制转录因子的表达。通过研究细胞在转录因子表达受抑制后的功能变化和基因表达谱改变，可以反向验证转录因子的生物学功能。

（2）基因敲除和敲入技术

1）基因敲除

借助CRISPR/Cas9等基因编辑技术，在细胞或动物模型中精准敲除转录因子基因。观察基因敲除后个体在发育过程中的表型变化、生理功能异常以及疾病发生情况，能够深入了解转录因子在整体生物体中的功能。例如，在小鼠模型中敲除某转录因子基因后，若小鼠出现神经系统发育缺陷，说明该转录因子在神经系统发育中具有关键作用。

2）基因敲入

除了敲除，还可以将特定的突变或修饰引入转录因子基因，即进行基因敲入操作。通过研究基因敲入后转录因子功能的变化，能够进一步明确转录因子结构与功能之间的关系，以及特定氨基酸位点对其功能的影响。

03.转录因子相互作用研究

（1）酵母双杂交系统

是研究蛋白质-蛋白质相互作用的经典技术，同样适用于探究转录因子与其他蛋白的相互作用。实验中，将转录因子作为诱饵蛋白，与文库中的猎物蛋白进行相互作用筛选。当诱饵蛋白和猎物蛋白相互作用时，会使酵母细胞中的报告基因表达，通过筛选报告基因表达的酵母细胞，即可鉴定出与转录因子相互作用的蛋白。该技术能够大规模筛选与转录因子相互作用的蛋白，有助于构建转录因子的调控网络。

酵母双杂交系统示意图

（2）免疫共沉淀（Co-IP）

利用特异性抗体沉淀与转录因子相互作用的蛋白质复合物。实验时，首先用针对转录因子的抗体捕获与转录因子结合的蛋白质复合物，然后通过洗脱等步骤分离复合物中的蛋白质。最后，借助质谱分析等方法鉴定复合物中的蛋白质成分，从而确定与转录因子直接相互作用的蛋白。免疫共沉淀技术能够反映细胞内天然状态下蛋白质之间的相互作用，是研究转录因子调控网络的重要手段之一。

免疫共沉淀（Co-IP）示意图

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