DNA聚合酶是PCR实验中重要的参与物质，其在PCR反应中促进核酸片段按碱基互补配对进行延申，但其在体外合成过程中会产生一定概率的错配，导致复制的DNA序列错误。一般的菌落PCR等分析实验对序列的准确度较低，但克隆、测序模板制备、蛋白表达、突变检测、基因筛选及变异研究等实验应用中，对PCR扩增序列的准确度要求则较高，此种情况就需要选择具有高保真度的DNA聚合酶，以保证扩增过程中的保真度。

保真度

DNA聚合酶的保真度是指其进行准确扩增模板的能力，保证DNA序列准确。高保真度的DNA聚合酶，具有3’→5’核酸外切酶活性，当不正确的碱基掺入时，聚合酶会识别错误核苷酸并将之切除，重新聚合正确的核苷酸，所以可以精确读取和复制模板序列并优先结合正确的核苷酸，从而实现精准扩增。

高保真DNA聚合酶的5’→3’聚合活性位点与3’→5’核酸外切酶活性是相分离的，在扩增过程中当错误的核苷酸掺入时DNA合成会因碱基配对动力学影响发生暂停，此时3’→5’核酸外切酶会切除错配碱基并替换为正确的核苷酸。

错配率是DNA聚合酶保真性的通用指标，是指在PCR产物中发生错配的核苷酸数目与聚合的总核苷酸数目的比值，错配率越低则保真性越好。保真度常用错配率的倒数表示，即保真度=1/错配率。所以DNA聚合酶的保真度与PCR扩增子长度和扩增循环数密切相关，因此在比较不同种类DNA聚合酶的保真度时必须使用相同的方法与参数进行扩增。

保真度测定方法

方法较多，如恒定变性毛细管电泳（CDCE）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、PCR/RFLP、蓝白班筛选、一代（Sanger）测序和NGS测序等。常用的主要为后三者。

1.蓝白斑筛选方法

原理：利用DNA聚合酶扩增lacZ基因，基于lacZ基因的α-互补性，它能还原β-半乳糖苷酶基因活性，并产生蓝色菌落，结合蓝白斑筛选评估保真度。利用lacZ基因编码的α肽链（酶的N端）与β-半乳糖苷酶缺陷型菌株表达的β-半乳糖苷酶的C端互补，形成具有活性的β-半乳糖苷酶从而具有分解X-gal生成蓝色物质的能力，产生蓝色菌落，结合蓝白班筛选，对DNA聚合酶保真度进行测定。

步骤：用待检测DNA聚合酶扩增lacZ基因，将PCR产物连接到线性载体上形成重组质粒，再将重组质粒转化宿主菌进行平板涂布培养，最后进行蓝白斑筛选，统计蓝斑与白班数目，计算错配率，计算公式为：(1-错配率)^{碱基数×循环数}=蓝斑数/总菌斑数。若聚合酶的错配率导致lacZ基因扩增错误，则会使β-半乳糖苷酶活性失效，导致菌落呈现白色。

此方法成本低，无需配套仪器，但无法检测同义突变。

2.一代（Sanger）测序方法

原理：将DNA聚合酶PCR扩增产物克隆至载体上，对单菌落进行一代测序，对测序得到的错配的核苷酸数目进行统计分析，计算保真度。

步骤：根据DNA模板设计PCR扩增引物，用待检测DNA聚合酶进行PCR扩增，将PCR产物克隆至载体上，转化宿主菌平板涂布培养，然后挑取单菌落进行大批量一代测序，统计错配的核苷酸数目与聚合的总核苷酸数的比值，即错配率。

此方法精确度高，可检测到同义突变，但进行大批量测序的成本较高。

3.NGS测序方法

原理：将DNA聚合酶PCR扩增产物按NGS平台读长所需进行片段化处理，然后利用NGS平台进行测序分析，对测序得到的错配的核苷酸数目进行统计分析，计算保真度。

步骤：根据DNA模板设计PCR扩增引物，用待检测DNA聚合酶进行PCR扩增，将PCR产物打断建库，利用NGS平台进行双向测定，筛选正反两个方向均有效的数据，即在突变的判定过程中，正反两个方向均测定出突变的位置记为一次突变，此突变属于DNA聚合酶错配率引入的突变；如只有一个方向测定出现突变，另一个方向测定无突变，则该突变为测序平台引入的突变，不属于DNA聚合酶扩增引入的突变，计算DNA聚合酶扩增引入的突变与有效DNA测序量的比值，即错配率。

此方法精确、快速，也可检测到同义突变；但需要更专业的测序平台或其他仪器，且测序读长受限。

Tips：在PCR扩增中，不同的序列引入突变的概率是有差异的，一般选择多个扩增产物进行测序比较，扩增的目的基因序列设置在容易导入基因突变的富含GC序列区域以及重复等区域。

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