MeRIP-seq测序的基本实验流程为：

Total RNA提取质检—目标RNA富集及片段化—抗体免疫沉淀富集m6修饰的RNA文库构建（IP）/常规转录组文库构建（input）—高通量测序（PE150模式）—数据分析。

在开展此实验前有一个至关重要的环节经常被忽视，而它往往是决定MeRIP-seq测序结果好坏的关键一步，那就是前期的样本准备环节。高质量的实验样本，是一个实验良好的开端，与后期的数据质量也紧密相关。接下来，让我们来了解一下生工生物汇总的多个MeRIP-seq测序项目样本备样经验，希望能对老师的实验开展有所帮助。

1.样本准备的通用原则

1. 代表性原则：

① 根据实验设计或参考相关文献，科学谨慎地选择具有代表性的取样部位；

② 请注意取材精准，不含累赘部位（病变不含正常部位，正常部位不含病变部位）。

2. 一致性原则：

组内生物学重复样本，在时间和空间上取材尽可能保持一致，减少变量。

3. 迅速性原则：

在样本收集、准备、储存中尽可能做到迅速，缩短样本收集到冻存的时间。

4. 低温性原则：

① 样本离体后，分离及清洗步骤，应置于低温环境（冰盒/碎冰、预冷的PBS/无菌水）中进行；

② 分离好后立即液氮速冻5-10 min，再转至-80°C冰箱或干冰中保存，使用足量干冰运输；

③ 需要特别注意要避免样本出现反复冻融的情况。

5. 准确性原则：

① 在样本收集、准备、储存中，需要准确记录样本特征特性并正确标记样本名称；

② 使用厚壁离心管或冻存管收集样本，管口使用Parafilm封口，且样本按照实验方案做好分装（自封袋/50 ml离心管），避免样本管由于冻存出现管裂造成交叉污染；

③ 特殊样品可采用干净的锡箔纸包裹样品后装在自封袋中，使用油性记号笔标注样本名称于锡纸及自封袋上。

6. 备份原则：

为了避免部分样品发生降解，需要重新取材、制备或送样，耽误实验进度，建议样品按需多管分装存储，至少备份1-2份。

2.不同样本类型的收集要点

1. 新鲜动物组织（样本量>=400 mg）

a）新鲜组织液氮速冻送样（推荐）：

① 新鲜组织离体后，立即剔除非研究所需的组织类型；

② 如果组织体积较大，应尽量将组织剪切成长宽高均<=0.5 cm的小块（约绿豆大小）；

③ 迅速用预冷的生理盐水或PBS将组织洗涤干净，并用无尘纸吸干水分；

④ 置于1.5 ml或2 ml的离心管中液氮速冻，然后转移至-80°C冰箱，足量干冰运输。

b）新鲜组织 RNA later 保存送样：

① 对一些临床组织样品，由于条件限制无法立即使用液氮速冻保存，为了保证后续提取RNA的完整性，可以使用 RNA later保存；

② 组织离体后需要立即分割、剪切成小块（绿豆大小）；

③ 用预冷的生理盐水或PBS去除血渍和污物；

④ 放入预装有RNA later（RNA组织保存试剂）的1.5 ml或2.0 ml RNase-free EP管或螺旋管中，后续操作按照说明书进行。

2. 新鲜植物组织（样本量>=500 mg）

a）地上部分（花、茎、叶等）：

① 幼嫩叶片和花瓣等组织直接取样，装进15 ml或50 ml离心管；

② 较大叶片需要用剪刀快速剪碎后装入15ml或50ml离心管；

③ 迅速置于液氮中冷冻，然后转移至-80°C冰箱，足量干冰运输。

c）地下组织（根、块茎等）:

① 分离出样本后，快速用灭菌水清洗（若无法达到条件，用普通水代替），用吸水纸吸走多余的水分后，快速装进15 ml或50 ml离心管；

② 如遇块根等组织，需要用工具切成1-2 cm大小块状才可以装入离心管。迅速置于液氮中冷冻，然后转移至-80°C冰箱，足量干冰运输。

d) 果肉组织：

① 利用工具将果肉切成1-2 cm块状大小，快速装进15 ml或50 ml离心管。

② 迅速置于液氮中冷冻，然后转移至-80°C冰箱，足量干冰运输。

3.   细胞类样本（活细胞数>= 5×10⁷）

a) 悬浮细胞：选取生长状态良好的细胞悬液；200-1000 g离心5-10min，弃培养基，得到细胞沉淀；加入适量RNase-Free水配制的1x PBS后，宽口枪头轻柔吹打重悬细胞沉淀，然后用200 g离心5 min，弃PBS，重复一次；加入1 ml TriZol 裂解液反复吹打至充分裂解，裂解充分的标准为吹打时液体不粘稠，流动性好（如果液体过于粘稠说明还未裂解充分，需添加裂解液，每次添加的量建议为100 μl左右持续添加，直到液体不粘稠为止）。迅速置于液氮中冷冻，然后转移至-80°C冰箱，足量干冰运输。

b）贴壁细胞：从培养箱取出贴壁生长细胞，显微镜下观察细胞确定生长状态良好弃培养基；小心加入与培养基等体积的无酶水配制的1x PBS后，平放1 min洗涤细胞，然后弃去PBS，重复一次（注意在在无菌条件下打开培养瓶（皿）盖子）；加入1 ml裂解液反复吹打至充分裂解，裂解充分的标准为吹打时液体不粘稠，流动性好（如果液体过于粘稠说明还未裂解充分，需添加裂解液，每次添加的量建议为100 μl左右持续添加，直到液体不粘稠为止）。迅速置于液氮中冷冻，然后转移至-80°C冰箱，足量干冰运输。

4. 血液样本（血液量>= 5 ml）

a）未冻存过的抗凝血新鲜全血：未冻存过的抗凝血新鲜全血，抗凝剂不可使用肝素钠，可用EDTA或ACD抗凝剂；取血后摇晃管子使血液与抗凝剂充分混匀；4°C短暂保存；以冰袋保存运输，注意血液样本不要与冰袋直接接触，不能使血液冻结。

b）冻存血液：直接用EDTA抗凝管抽血，边抽边轻摇，使血液和抗凝剂充分混合；抽出一部分和TRIzol混匀，200 μl全血加入到1 ml TRIzol里，TRIzol和血的大概比例=5：1，吹打混匀，不要有血块；迅速置于液氮中冷冻10 min左右，然后转移至-80°C或液氮中长期保存。

5. RNA样本

总量>=10 μg（浓度>=300 ng/μl，体积>=20 μl）；迅速置于液氮中冷冻10 min左右，然后转移至-80°C或液氮中长期保存。

3.生工推荐

生工生物工程（上海）股份有限公司自2011年成立高通量测序部以来，逐步引进了Illumina，Life，DNBSEQ，PacBio、Nanopore、等二代/三代测序平台。建立了2000平米高标准实验室（通过了国家ISO认证）并搭建了50PB级存储及运算能力的服务器集群，能满足绝大多数科研客户的研究需要。同时，生工高通量测序团队建设也在不断完善中，目前有100余专职员工，其中高级技术人员以及高级生物信息工程师占比50%以上，10年来，通过生工高通量测序服务所发表的文章累计影响因子在10000分以上。

生工生物现可提供RNA m6A甲基化测序（MeRIP-seq），感兴趣的小伙伴欢迎来电与我们技术支持沟通交流。

技术支持联系电话：021-5707 2059 / 2179

技术支持联系邮箱：ngswanglu@sangon.com / RNAseq3@sangon.com