离心技术
离心,应该是大家实验室中稀松平常的事情,离心管、离心机,伴随着这种样品处理过程经常被用到。
离心技术,也算是学科之间互相理解应用的典型例子,里面包含了物理的知识点,是根据物质颗粒在做匀速圆周运动时受到离心力的行为而建立起来的一种分离技术。当物体围绕一个中心轴做圆周运动时,依照牛顿运动定律,会受到一种惯性作用,使其远离中心轴,把这种惯性作用称之为离心力这样一种虚拟力。离心力F=mω2r,m为物质颗粒的质量,ω为转动的角速度,r为转动半径,所以样品在离心机中做离心处理时,转动的速度越高,离心转子的半径越大,那么受到的离心力就越大。
将装有悬浮液或高分子溶液的离心管做高速水平旋转,达到重力加速度g上百、上千甚至上万倍的离心力作用于溶液中的悬浮颗粒或高分子以及溶剂,与其中的阻力、压力形成的浮力等的最终作用会使溶液中的悬浮颗粒或高分子产生相对的沉降或漂浮。当悬浮颗粒或高分子密度大于周围的溶剂介质,则会沿着离心力的方向运动而逐渐背离中心轴进行相对沉降;相反,若小于周围的溶剂介质,则会朝向中心轴运动进行相对漂浮。
在离心机内同一转速下,离心管中不同的悬浮颗粒或高分子会以不同的速率沉降或悬浮,经过一定时间的离心处理,就有可能实现不同悬浮颗粒或高分子的有效分离。
在生命科学研究中广泛使用离心,例如将细胞、细胞器、病毒和生物大分子等制成悬浮状态,进行离心分离,分离出天然的生物大分子、细胞、细胞器以及化学反应后的沉淀物等。
#G508009 高速微量离心机,100~21000 Xg
沉降速率
悬浮颗粒在离心力场中的沉降速率,自身影响因素主要为:颗粒的体积,其直径越大,则沉降速度越大;颗粒的形状,主要影响受到溶剂的摩擦阻力,比如流线形受到阻力小,则沉降速率大;颗粒的密度,密度越大,则质量越大,所受沉降方向的力也越大,沉降速率越大。外在因素,沉降速率与离心机的旋转半径、离心速度以及溶剂介质的密度等也有关系。但在同一离心机中进行离心,这些因素是相同,所以就取决于颗粒自身因素。
常用方法
生物实验中常用到的离心技术主要为两类离心方法,一类是差速离心,一类是密度梯度离心。
差速离心
在均匀的介质中混装有不均一悬浮颗粒,盛于离心管在离心机中高速旋转,体积、形状、密度不同的粒子将以各自的沉降速率移向离心管底部,控制转速和时间,沉降速率最大的组分将首先沉淀在离心管底部,沉降速率中等及较小组分将继续留在上清液中。将上清液转移至另一离心管中,提高转速,控制时间,即可获得沉降速率中等的组分。后续依此类推,就可在不同转速下,得到沉降速率不同的各组分的分离。
例如细胞匀浆,一般通过此方法,可依此分离出细胞核、线粒体、高尔基体、核糖体和大分子复合物以及病毒等。因此常用作分离有生物活性的物质,如动植物病毒、各种亚细胞组分(细胞核、叶绿体、线粒体等),以及核酸和蛋白质等生物大分子的分离、粗提和浓缩。
此方法操作简易,每次离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开。但费时,须多次离心,且不易完全分离沉淀中个别其他组分杂质,分离效果较差。
密度梯度离心
将样品加在惰性梯度介质中进行离心,在离心力等多种作用力下将颗粒分配到梯度中的某些特定位置上。此类离心具体又可分为两种原理方法:等密度沉降和速率区带沉降。
等密度沉降
适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间可沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处,并停留在那里达到平衡,从而将不同密度的细胞或细胞器分离。常用介质有氯化铯(点击名称可在生工官网了解及购买)、硫酸铯和三碘甲酰葡萄糖胺以及其他的梯度分离液等。
例如,采用氯化铯处理密度沉降,其为一种重金属,无色晶体,易溶于水,可形成1~1.9 g/cm3的密度梯度。将氯化铯溶液高速离心较长时间,离心过程中离心力使该盐向离心管底沉降。当管底盐溶液浓度偏高时,该盐又受到扩散作用向管口移动。但其扩散作用力远小于离心力。最终沉降和扩散之间达到平衡,这时从管的顶部到底部形成该盐线性的密度增加的梯度。样品离心时,不同悬浮颗粒在离心力造成的综合受力向与其密度相等的等密度点位置移动,形成几条不同的区带。
适用于分离核酸、亚细胞器等,也可以分离复合蛋白质,但不适用于简单的蛋白质。
此方法在体系到达平衡状态后,再延长离心时间和提高转速不会破坏已形成的区带,处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响。而提高转速可以缩短达到平衡的时间,离心所需时间以最小颗粒到达其等密度点的时间为基准。
速度沉降法
主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。离心管内先装入蔗糖、甘油、氯化铯(点击名称可在生工官网了解及购买)或其他的梯度分离液等密度梯度介质,样品粒子的密度必须大于梯度液柱中任一点的密度,被分离的粒子在梯度液中沉降速度不同,离心时,混合样品中不同的组分将在梯度液柱的不同位置分别形成各自的区带,达到彼此分离的目的。
仅适用于分离有一定沉降系数差的颗粒(≥20%的沉降系数差)或相对分子质量相差3倍以上的蛋白质。不适用于大小相同、密度不同的颗粒,如线粒体、溶酶体等。
选择合适的离心转速和时间是此方法的关键。
另外,也发展出了其他一些离心技术,但都是需要配备特殊的离心机或转头。
例如,分析超速离心法,采用的分析型超速离心机主要由一个椭圆形的转子、一套真空系统和一套光学系统所组成。光学系统可保证在整个离心期间都能观察转子的分析小室中正在沉降的物质,可通过对紫外光的吸收(如对蛋白质和DNA)或折射率的不同对沉降物进行监测,得到物质沉降速度的指标。
离心作为生物实验中常用的一种样品处理方法,为后续实验提供了重要的分析样本。生工生物也一直为广大客户提供最最基本的离心管类耗材,欢迎了解咨询!