RNAi的发现过程
美国麻省大学医学院分子医学教授克雷格·梅洛与斯坦福医学院病理学和遗传学教授安德鲁·法尔发现RNA干扰现象，共同获得了2006年诺贝尔生理学或医学奖。在他们的研究之前，人们只是认识到基因通过mRNA合成蛋白质，展现生命的功能，他们的成果首次让大家知道，生物体内一些特殊的RNA，可以降解mRNA，从源头上让基因“沉默”，这一过程被称为RNA干扰。以下是RNA干扰的发现过程：
RNAi的定义
如果将RNAi看做一种生物学现象则：RNAi是由双链RNA（dsRNA）介导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象，具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。
如果将RNAi看做一门生物技术则：RNAi是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的现象，它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的dsRNA(正义RNA和反义RNA) ，从而诱导内源靶基因的mRNA降解，抑制靶基因表达的技术。
不同的角度虽然对RNAi的定义有所不同，但所描述的实事大体相同，可以用一句话来概括，即RNAi就是指由dsRNA介导的基因沉默现象。
RNAi作用的机理
（1）RNAi的作用机制通过三种途径来抑制同源靶基因的表达：
-
触发基因编码的mRNA的降解；
-
抑制mRNA的翻译；
-
对靶基因所在染色质进行修饰而沉默其转录。
（2）总过程分为三个阶段：
A. 起始阶段
加入的较长的dsRNA被Dicer核酸酶切割为短双链RNA，即21~23 nt大小的siRNA片段。
B. 效应阶段
siRNA激发细胞中几种蛋白质聚合和组装成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，称为RISC( RNA-induced silencing complex，RISC) 。RISC具有识别siRNA的能力，同时具有内切核酸酶及解旋酶的活性，可将siRNA双链解旋为单链，单链中的引导链( guide strand) 与靶mRNA通过碱基互补配对而结合，在ATP供能的情况下，RISC中核酸内切酶( slicer)切割靶mRNA，将mRNA切割降解，当siRNA与靶mRNA不完全匹配时，靶mRNA翻译过程受到抑制从而达到基因沉默效果。
C. 扩增阶段
siRNA与mRNA结合，作为引物，在RNA聚合酶（RdRp）作用下再次形成dsRNA，然后重复起始阶段和效应阶段，进一步放大RNAi的作用，最终将靶mRNA完全降解[1]。
图1. siRNA诱导的RNA干扰动态机制图[2]
（3）miRNA诱导的RNA干扰机制
细胞自身转录出的初级miRNA分子，在细胞核内经过一系列加工，运出细胞核，被Dicer酶切割形成成熟的单链miRNA，经过RNAi的启动阶段及效应阶段实现转录后基因沉默。
图2. miRNA诱导的RNA干扰动态机制图[2]
siRNA与miRNA诱导RNA干扰机制差异对比
| 名称 | 差异对比 |
| miRNA诱导的RNA干扰机制 |
1) 成熟miRNA以单链形式存在； 2) Dicer酶对前体miRNA进行的是不对称加工，产生的miRNA来自具有发夹结构前体miRNA的一侧臂； 3) miRNA参与正常情况下的生长发育基因调控并具有保守性、时序性和组织特异性。 |
| siRNA诱导的RNA干扰机制 |
1) siRNA一般是双链RNA分子； 2) 对siRNA是对称加工，siRNA对称来源于dsRNA的两侧臂； 3) siRNA只在病毒或dsRNA诱导情况下才产生。 |
siRNA诱导的RNA干扰机制 miRNA诱导的RNA干扰机制
图3. siRNA与miRNA诱导RNA干扰机制差异对比图[2]
RNAi技术应用
（1）在生物学基础研究中的应用
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真核细胞基因功能的研究: 传统的基因功能研究方法相比，RNAi技术是一种高效、特异、快捷和成本相对低廉的基因功能研究手段[3]。
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信号转导通路的研究: 利用RNAi技术可以容易地确定复杂的信号转导途径中相关基因的上下游关系及其作用[4]。
（2）在农业领域中的应用
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在植物抗逆性改良中的应用: 通过RNAi技术对植物抗逆相关基因挖掘及功能的研究，对于培育具有较强抗逆性的植物新品系至关重要[5]。
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在生物防治中的应用: 近几年来，随着RNAi技术的发展，对未知基因功能的研究越来越多，在害虫防治中也发现了一些合适的靶基因[6]。
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在昆虫抗药性中的应用: RNAi技术可为害虫抗药性机理的研究提供有效途径。
（3）在医学中的应用
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在疾病预防中的应用: 肉类安全问题一直受到社会各界的广泛关注，其中牲畜疾病是严重威胁肉类安全的主要因素。研究者针对禽流感病毒( AIV) 的核蛋白和聚合酶酸性蛋白，利用siRNA细菌载体递送到禽黏膜上皮细胞，结果发现这种新型抗AIV载体能够抑制AIV并将病毒滴度降低1000倍[7]。
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在疾病治疗中的应用: 利用RNAi技术对靶位点局部用药，尽量减少用药给机体带来的副作用，是肿瘤和癌症治疗的重要发展方向。
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在药学中的应用: 利用RNAi可以进行药物研发，能够在短时间内获得具有特异、高效地抑制基因表达，甚至获得完全去除特殊基因功能表型的药物及其基因靶点，从而实现在细胞水平和动物水平筛选和评定药靶。
常用的基因干扰工具及区别
常见的干扰工具主要包括化学合成的双链小干扰RNA（siRNA）和基于载体的短发夹RNA（shRNA）。
| 性能 | siRNA | shRNA |
| 稳定性 | 稳定性低易降解，寿命短 | 高 |
| 作用是时效 | 作用时间较短，一般为一周左右 | 作用时间较长，可持续数星期甚至更长时间 |
| 脱靶率 | 高 | 低 |
| 导入细胞方式 | 普通转染，对于难转细胞的转染效率低 | 导入方式多样（质粒载体/病毒载体） |
| 表达方式 | 直接化学合成 |
可由聚合酶II型和III型启动子驱动； 可使用诱导表达系统； 可与报告基因共表达，可视化细胞导入效率。 |
| 控制效果 | 均取决于靶蛋白的半衰期 | |
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| 化学合成RNAi服务 | RNAi 双链设计 | 讨论实验方案，提供靶基因名称、序列或者GeneBank ID等信息。 |
| siRNA合成 | 普通siRNA、化学修饰siRNA、荧光标记siRNA、siRNA阴性对照、siRNA阳性对照 | |
| siRNA套餐 |
对每个靶基因(仅人、小鼠、大鼠编码基因)设计3条 siRNA(各5 nmol），套餐产品还附赠阳性对照和阴性对照各2.5 nmol、 在转染效率大于80%的情况下，保证至少一条mRNA水平抑制效率大于70%。如没有效果，免费重新合成设计合成3个靶点的siRNA oligos 。 |
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| siRNA/miRNA载体（质转）构建服务 | shRNA表达载体构建 | 构建1个目的基因的shRNA载体50 μg (含NC对照1个） |
| shRNA表达载体构建套餐 | 构建4个目的基因的shRNA载体套餐50 μg /个(含NC对照1个） | |
| mirshRNA表达载体构建 | 构建1个目的基因的mirshRNA载体50 μg /个(含NC对照1个） | |
| micoRNA表达载体构建 | 构建1个目的基因的mirshRNA载体50 μg /个(含NC对照1个） | |
| miRNA抑制剂(miArrest)表达载体构建 | 构建1个目的表达miRNA抑制剂(miArrest）载体50 μg /个(含阴性对照1个） | |
| RNA干扰 | 慢病毒介导siRNA实验服务 | 分为慢病毒介导的siRNA筛选和有效干扰稳定细胞系建立两个项目，包括细胞培养、shRNA载体构建、慢病毒包装和侵染、qPCR及WB检测等。 |
| 腺病毒介导的siRNA实验服务 | 包装干扰病毒、细胞侵染、qPCR、WB等。 | |
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参考文献
[1] 于志军,姚占祥,刘伟.RNA干扰技术的研究概述[J].生物学教学, 2020, 45(4):3.
[2] 王淑敏,高雪彦,刘东升,等.致病基因"猎手"--RNA干扰技术在分子生物学中的教学设计[J].生命的化学, 2022, 42(8):8.
[3] Dunn,SR,Phillips,et al.Knockdown of actin and caspase gene expression by RNA interference in the symbiotic anemone Aiptasia pallida[J].The Biological Bulletin, 2007.DOI:10.1353/ajm.2000.0018.
[4] Clemens J C , Worby C A , Simonson-Leff N ,et al.Use of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2000, 97(12):6499-6503.DOI:10.1073/pnas.110149597.
[5] 高梦烛,赵亚林,闫青地,et al.拟南芥PMRP基因在叶绿体淀粉粒积累和抗寒性中的作用[J].中国农业科学, 2016, 49(5):8.DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.05.003.
Guo Z , Kang S , Zhu X ,et al.The novel ABC transporter ABCH1 is a potential target for RNAi-based insect pest control and resistance management[J].Rep, 2015, 5(1):13728.DOI:10.1038/srep13728.
[6] Linke L M , Wilusz J , Pabilonia K L ,et al.Inhibiting avian influenza virus shedding using a novel RNAi antiviral vector technology: proof of concept in an avian cell model[J].Amb Express, 2016, 6(1).DOI:10.1186/s13568-016-0187-y.
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