揭示Pd1调控脑发育的生理及病理分子机制

神经发育过程是神经系统建立和功能实现的基础，发育异常会导致儿童期、青春期及成年期等多种神经疾病。据统计我国约有1/6的人群遭受各种神经疾病的折磨[1]，给家庭和社会带来沉重的经济和心理负担。因此解析脑发育生理机制，揭示脑发育缺陷致病机理是当前研究的重点，可以为神经系统发育紊乱导致的疾病提供诊断标准和治疗依据，关系到人类的健康，具有重大的社会意义和战略价值。

免疫分子不仅在免疫系统中具有重要作用，而且在神经系统发育过程中广泛表达并发挥新的调控功能。这些免疫分子异常导致的脑发育紊乱可能是脑疾病发病的重要基础，也是未来脑疾病防治的新突破口。目前免疫基因如何调控脑发育及其功能失调是否导致精神行为异常仍然缺少系统性的研究。PD1是重要的免疫分子，不仅在神经细胞中表达且该基因染色体定位区域（2q37）的缺失与精神行为异常密切相关，其在脑发育中的调控功能及神经疾病中的致病机理亟待阐明。从新的角度揭示了PD1在早期脑发育过程中的调控功能及机制，阐明了PD1在小鼠抑郁中的潜在发病机理，为解析PD1相关的精神行为异常提供脑发育方面的证据，为相关脑疾病的诊疗提供重要参考。

为探讨Pd1在脑发育过程中的调控功能，我们利用CRISPR/Cas9技术获得了Pd1^fl/fl小鼠。通过Pd1^fl/fl鼠与Nestin-Cre工具鼠杂交进一步获得Pd1脑特异性敲除小鼠（图1A）。当Pd1缺失时，Pd1的表达显著降低（图1B）。胚胎电转实验表明在Pd1^cKO小鼠中VZ/SVZ和IZ中GFP⁺细胞显著增加，CP中GFP⁺细胞数量显著减少（图1C，D）。与Pd1^fl/fl小鼠相比，Pd1^cKO小鼠的VZ/SVZ中BrdU标记的增殖细胞数量（图1E，F）增加。这些结果表明脑特异性敲除Pd1影响神经细胞分布及前体细胞增殖，导致脑发育紊乱。

图1 Pd1调控神经前体细胞增殖分化，影响脑发育过程

神经元正常的形态发育对于神经网络和功能的形成至关重要，其形态异常是造成神经系统疾病的重要因素。为此我们进一步追踪了Pd1敲除及敲降后的神经元形态变化。通过胚胎电转技术在E15将对照质粒和敲降质粒电转至胎鼠大脑。在出生14天后检测神经元形态。与正常组相比，Pd1敲降后神经元树突的分支数和长度明显减少。将Pd1^fl/fl和Pd1^cKO小鼠的神经元同时进行体外分化培养，Pd敲除神经元形态出现异常，树突长度明显减少。结果表明Pd1敲除/敲降导致神经元形态异常。

Pd1脑特性敲除造成的脑发育及神经元形态异常是否进一步影响小鼠的外在行为改变？为此我们进行了系列行为学实验。发现在强迫游泳实验中Pd1^cKO小鼠从入水到不动的时间明显缩短（图2A），不动时间明显延长（图2B）。在悬尾实验中，Pd1^cKO小鼠的不动时间增长（图2C）。以上两实验表明在压力条件下Pd1^cKO小鼠比Pd1^fl/fl小鼠更容易放弃和绝望。糖水偏好实验表明Pd1^cKO小鼠的糖水消耗量明显低于对照组（图2D），表明Pd1^cKO小鼠快感缺失。三箱社交实验中Pd1^cKO小鼠与陌生鼠无明显的交流倾向，存在一定的社交障碍（图2E、F）。以上行为学实验表明Pd1敲除小鼠产生了类似抑郁症的绝望、快感缺失及社交障碍等行为特征。

图2 Pd1条件性敲除导致小鼠产生抑郁样行为

转录组测序结果表明Pd1可能通过Pax3调控脑发育过程，挽救实验进一步证实了该结果。那Pd1如何调控Pax3表达？蛋白质印迹分析表明AKT/GSK3β/β-catenin信号通路参与了Pd1对Pax3的调节。当Pd1敲除时，p-AKT/p-GSK3β（S9）/β-catenin的水平增加，而p-GSK3-β（Y216）/p-β-catenin的水平降低（图3A）。为了检测β-catenin的减少是否可以挽救由Pd1敲低引起的大脑发育缺陷，分别将Pd1 shRNA和对照质粒电穿到胚胎大脑中。然后将β-catenin抑制剂XAV939和DMSO腹腔注射孕鼠。与DMSO注射组相比，给予XAV939可以部分挽救由Pd1下调引起的大脑发育缺陷（图3B，C）。表明Pd1通过AKT/GSK3β/β-catenin信号通路调节Pax3的表达从而参与脑发育过程。

图3 Pd1调控脑发育的潜在机制

先前的报道表明，XAV939通过促进海马神经发生在成年小鼠中具有抗抑郁作用[2]。为了确定XAV939是否可以挽救Pd1^cKO小鼠的抑郁样行为，从E13开始，通过每天腹膜内注射一次XAV939直到Pd1^cKO小鼠和Pd1^fl/fl小鼠出生。出生后第六周进行行为测试。强迫游泳实验显示在Pd1^cKO小鼠中给予XAV939显著降低了不动时长并增加了不动的潜伏期。在悬尾实验中，XAV939治疗也减少了Pd1^cKO小鼠的绝望程度。XAV939给药后，Pd1^cKO小鼠和Pd1^fl/fl小鼠对糖水的偏好没有显著差异，表明Pd1^cKO小鼠的快感缺失可以被挽救。同时，Pd1^cKO小鼠与陌生小鼠的接触增多，社交互动缺陷得到改善。在所有行为测试中，DMSO处理对Pd1^cKO小鼠的抑郁样行为没有影响。这些结果表明，XAV939治疗改善了Pd1^cKO小鼠的抑郁样行为缺陷。

文章结论与讨论，启发与展望

综合所述，该研究表明Pd1在神经系统的表达对于脑发育过程具有重要的调控作用，不仅影响神经干细胞增殖分化和神经元的形态，而且其敲除后小鼠外在行为异常，出现类似抑郁症的行为特征。机制研究表明Pd1通过AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路调控Pax3表达从而参与对大脑发育的调节。Pax3敲降或XAV939干预可以部分挽救由Pd1缺失引起的神经发育缺陷。给予XAV939注射可以改善Pd1^cKO小鼠的异常行为。该研究结果阐明了Pd1在大脑发育中的非免疫调控功能，为探讨免疫分子在大脑发育过程中的生理和病理意义提供了新的线索。