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发现调控Shh型髓母细胞瘤发生发展的新调控机制

发布日期：2023/8/28 21:15:00
髓母细胞瘤（medulloblastoma, MB）是一种起源于发育中的小脑的胶质瘤，是儿科最常见的恶性颅内肿瘤, 根据其分子、临床、病理和预后特征，MB分为四种类型：Wnt型、Shh（Sonic hedgehog）型、以及非Wnt/Shh激活的3型（Group 3）和4型 (Group 4)，其中，Shh亚型占到髓母细胞瘤患者的30%左右。在小脑发育过程中，Shh与位于外颗粒细胞层（External granular layer，EGL）的小脑颗粒祖细胞上的抑制型细胞膜受体Ptch1结合，该结合解除了Ptch1对下游激活型跨膜受体Smo的抑制，从而激活并促进下游信号传导过程，包括转录因子Gli的入核及其靶基因的转录激活，诱导位于外颗粒细胞层的颗粒神经元前体细胞（cerebellar granule neuron precursor, CGNP）的增殖，以此维持EGL的扩增和正常发育。小脑发育后期Shh信号通路的持续活化会导致髓母细胞瘤的发生，因此Shh信号通路调控机制的研究将为Shh亚型髓母细胞瘤的诊疗提供依据。进一步深入探讨了Shh亚型髓母细胞瘤发生发展中Shh信号通路调控的分子机制，为Shh亚型髓母细胞瘤的的诊疗提供了重要理论依据和新的靶点支持。
 
 
该团队早期的研究表明，泛素连接酶RNF220通过靶向PRC2复合物成员EED的泛素化和蛋白降解正向调控Shh信号通路，在小脑发育和Shh亚型髓母细胞瘤发生发展中起重要调控作用（Ma et al, 2020, Development）。该团队的部分研究结果提示，RNF220蛋白通过一种翻译后调控机制在Shh亚型髓母细胞瘤中积累高表达，但关于该类型调控的分子机制仍不清楚。Smurf1和Smurf2是属于HECT型E3泛素连接酶家族，通过调控多个蛋白靶点参与包括Wnt、BMP、JNK和Shh等在内的多个信号通路的调控。在Shh信号传导过程中，Smurf1和Smurf2通过多泛素化修饰介导Ptch1的溶酶体降解，从而促进Smo激活；同时，Smurf1和Smurf2也能够直接泛素化Smo并促进其降解。在小脑发育过程中，Smurf1或Smurf2的缺失影响CGNP细胞Shh信号通路的激活以及其细胞增殖。同时多项研究显示：在不同类型肿瘤的进展过程中，Smurf1和Smurf2通过调控不同靶蛋白起到抑制或促进肿瘤发展的作用。但是，关于Smurf1和Smurf2在Shh亚型髓母细胞瘤的发生发展中的功能及作用机制缺乏系统的研究。
 
为了探索RNF220蛋白的翻译后调控机制，作者首先通过酵母双杂交的筛选发现：泛素连接酶Smurf1和Smurf2与RNF220蛋白存在相互作用。随后，作者通过一系列的免疫共沉淀实验证实了RNF220与Smurf1和Smurf2的蛋白互作，且发现：该团队以前研究中发现的RNF220蛋白上的两个磷酸化位点（S282和S286）对其与Smurf1和Smurf2的相互作用至关重要（Ma et al, 2014, Mol Cell Biol）。进一步，作者通过体内和体外的泛素化实验和蛋白半衰期的检测分析发现：Smurf1和Smurf2能够催化RNF220蛋白的K48类型多泛素化修饰和蛋白酶体介导的蛋白降解，进而调控RNF220蛋白的稳定性。
 
为了检测上述调控反应的具体功能，作者首先在两种不同的Shh型髓母细胞瘤细胞系Daoy和UW228中检测了Smurf1和Smurf2对RNF220介导的Shh信号通路调控的影响。结果发现：在这两种野生型的细胞系中，敲低Smurf1和Smurf2显著上调RNF220的蛋白表达、促进Shh信号通路的激活及其介导的细胞增殖能力、加快细胞系在裸鼠中的成瘤速度。然而，在RNF220敲低或缺失的细胞系中，敲低Smurf1和Smurf2对Shh信号通路的激活和细胞增殖的促进作用大大降低。随后，作者检测了Smurf1和Smurf2在Shh亚型髓母细胞瘤组织中的表达情况。与正常的小脑组织相比，Smurf1和Smurf2的mRNA和蛋白水平在Ptch1+/-小鼠自发的髓母细胞瘤组织中都显著下调，与RNF220的蛋白表达成负相关。最后，作者通过免疫组织化学实验手段检测了人类临床髓母细胞瘤样本中RNF220、Smurf1和Smurf2、以及GAB1（Shh亚型髓母细胞瘤的分子标记）的蛋白表达水平及其相关性，结果也证实：在人Shh亚型髓母细胞瘤临床样本中，Smurf1和Smurf2蛋白水平与RNF220和GAB1的蛋白水平呈现显著的负相关性。
 
图1. 人类临床MB样本中GAB1、RNF220、Smurf1和Smurf2之间的蛋白质表达相关性分析。
 
文章结论与讨论，启发与展望
该项研究明确了泛素连接酶Smurf1和Smurf2在Shh亚型髓母细胞瘤发生发展中的功能，阐明了RNF220在Shh亚型髓母细胞瘤组织中高表达的分子调控机制；该工作为Shh亚型髓母细胞瘤提供了新的潜在诊断和药物靶点。
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