在细胞信号传导的复杂网络中，IKK（IκB 激酶）如同一位关键的 “信号调控师”，其磷酸化状态更是科研领域的焦点。IKK激酶复合物（IκB kinase）是NF-κB信号通路的枢纽，调控炎症、免疫应答、细胞凋亡等关键生理过程。然而，在WB实验中，磷酸化IKK的检测充满挑战，无条带，背景高，条带模糊等问题层出不穷，实验中的每一步都可能会影响最后的结果。今天，小优带领大家深入探讨IKK磷酸化在WB实验中的要点，助力攻克这一难题。

IKK结构和功能

IKK 复合体是由两种激酶（IKKα 和 IKKβ）和一个调节亚基 NEMO/IKKγ 组成。IKKα 和 IKKβ 具有相似的结构，包括一个 N 端激酶结构域（KD），是催化活性的核心区域，负责磷酸化底物；一个泛素样结构域（ULD）和一个螺旋支架二聚体结构域（SDD），介导亚基间的相互作用，使 IKKα 和 IKKβ 形成同源或异源二聚体^[1]，而二聚体的形成是激酶活性的基础。IKKγ（NEMO）则是调节亚基，其 N端区域与 IKKβ 具有高亲和力，中心卷曲螺旋区域参与多种蛋白相互作用，C端锌指结构域（LZ）能与多泛素链结合，介导IKK 复合体的激活^[2]。

图1  IKK复合体

IKK 激酶复合物是 NF-κB 级联反应的核心元件，IKK复合体的激活主要依赖于IKKβ中Ser177和Ser181的磷酸化（IKKα中的Ser176和Ser180），磷酸化后会引起构象变化，从而导致激酶激活^[3,4]。研究发现，IKKβ主要负责经典通路的激活，以及响应TNF-α、LPS等刺激，磷酸化IκBα的Ser32/36位点，触发其泛素化降解，释放NF-κB入核。IKKα主导非经典通路，在被NIK激酶激活后，磷酸化p100蛋白（NF-κB2前体），促使其加工为p52，与RelB形成二聚体调控B细胞分化、淋巴器官发育。

图2  NF-κB经典途径和非经典途径

IKK复合体特殊的结构，及其不同亚基激活的特点都会影响后续检测，那在实际实验中，应怎样操作才能得到满意的条带呢，下面让小优带大家来一起看看在WB中如何力挽狂澜。

WB检测要点

01样本刺激处理

适当的细胞刺激是诱导 IKK 磷酸化的关键。刺激不足，IKK 磷酸化水平低，刺激过度，细胞应激反应异常，产生非特异性磷酸化等干扰，且不同细胞类型对刺激物的敏感性不同，如某些细胞对 TNF-α 敏感，而另一些细胞则对 LPS 反应更强烈，实验中需反复摸索刺激条件。我们之前有总结过一篇文章，大家可以参考下：【小优细节君】P65磷酸化如何刺激？文献来解答！

02合适的收样时间

磷酸化IKK状态是呈现动态变化的，从刺激到磷酸化达到峰值再到下降时间较短，且不同细胞系也有一定的差异，收样时间不准可能会错过检测最佳时机，导致结果无条带或条带模糊。例如THP-1细胞磷酸化IKK的半衰期是LPS刺激后2小时左右。因此在实验前建议先进行预实验，每隔5min收集一次样本，通过多次收样确定样本刺激处理后磷酸化IKK达到峰值的时间点。

图3 LPS刺激THP-1细胞不同收样时间IKK的磷酸化程度

03合适的抗体选择

04检测“双内参”

检测磷酸化蛋白的同时，必须检测总蛋白，在结果分析中，更要通过磷酸化和总蛋白的比值，排除表达量波动的干扰；另也要检测体系内参（GAPDH、Actin等）以确保上样量一致。

05其他实验细节

（1）样本制备过程中添加足量磷酸酶抑制剂，防止蛋白降解；在制样过程中增加超声处理，尽可能的充分裂解样品，暴露抗原表位。使用新鲜样本进行实验；

（2）对于磷酸化的抗体，封闭剂的选择也十分重要，需根据一抗进行调整，例如CST抗体推荐应用新鲜配制的实验级脱脂奶粉。

（3）p-IKK的分子量在85kd左右，在电泳时要选择合适的凝胶浓度，一般是8%-10%的凝胶，或4-20%的梯度胶。适当增加转膜时间，转膜过程中全程保持低温。

磷酸化IKK在WB实验中虽挑战重重，但只要在实验的各个环节精心操作、细致优化，掌握这些实验要点，相信大家一定能有效提高检测成功率和准确性。为IKK在细胞信号传导中的作用机制，相关疾病研究和治疗提供有力的实验依据。

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参考文献：