利用新方法生成化学工具以研究GPCRs-配基结合
01要点概述
Promega用于监测GPCR与配基相互作用的新工具：
● HiBiT生物发光肽标签
- 非常小
- 与 LgBiT 高亲和力互补后产生明亮的发光
- 选择性细胞表面检测
● 通过BRET检测配基结合
- 高特异性：由于BRET固有的距离限制
- 结合亲和力与动力学的定量分析
- 非放射性
● 基于细胞的均质型检测
- 细胞环境会影响亲和力、结合率和下游信号传导
- 适合自动化和高通量筛选
02基本介绍
G蛋白偶联受体（GPCRs）一直是新型治疗药物的重要靶点。因此，在生物学相关条件下深入了解它们与生物活性化合物（包括结合亲和力和动力学）的相互作用，对于药物发现和基础研究都是至关重要的。为此，Promega开发了生物发光共振能量转移（BRET）测定法，用于定量活细胞表面特定GPCRs上的动态结合相互作用。该测定法结合了BRET的特异性与由发光HiBiT肽提供的高灵敏度。通过竞争性结合荧光示踪剂，BRET用来定量配基与其相应HiBiT标记的GPCR之间的相互作用。同时，HiBiT与细胞非渗透性LgBiT的高亲和力互补限定了明亮的生物发光供体信号在细胞表面，并消除了来自细胞内受体的发光背景。值得注意的是，荧光示踪剂的可用性仍然是该方法的一个瓶颈。缓解为每个受体开发特定示踪剂负担的一种方法是使用泛亲和性的示踪剂，这得益于BRET固有的特异性。在这里，我们强调了利用机器学习指导的计算机筛选来识别对GPCRs显示泛亲和性结合的骨架结构，这些骨架结构可以进一步修饰上荧光基团。此外，我们展示了这些基于BRET的结合测定法在终点和动力学模式下研究GPCR-配基相互作用的实用性。
03定量配基与GPCRs的选择性结合
HiBiT标记提供了：
小且干扰极小的标签
选择性的细胞表面检测能力
细胞不可渗透的LgBiT限制了信号产生的位置仅限于细胞表面
通过BRET检测GPCR配基结合提供了：
高特异性和高灵敏度
允许使用泛亲和性示踪剂进行选择性检测
定量检测
均质、活细胞实验方法
04应用数据展示
01配基与β2-AR的结合
平衡与动力学分析中获得相似的结合常数
02针对β-ARs的配基选择性分析
对于特定受体的效能等级顺序普遍与已报道的值相符。
03开发泛亲和性GPCRs示踪剂的方法
基于机器学习的体内筛选策略寻找泛亲和性化合物
训练机器学习算法以识别已知GPCR-配基相互作用中的化学结构中共通的模式。
利用此算法对化学数据库进行基于配基的虚拟筛选，旨在发现具有多GPCR结合潜力的分子。
04使用反应性NanoBRET 590 Dyes合成示踪剂
NanoBRET 590荧光团对细胞渗透性的影响最小，并且与HiBiT/LgBiT之间具有最佳的光谱重叠。
生物活性化合物与荧光团之间的linker可能会影响示踪剂的细胞渗透性、溶解度以及结合特性。
05示踪剂开发
实证筛选验证了大部分由机器学习预测的相互作用。
06Clozapine示踪剂的结合分析
单一的Clozapine示踪剂能够对5个不同家族的18种GPCRs进行结合分析。
05技术资源
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