今天是《抗体选择超全指南》专题的第三期，前两期我们介绍了《抗体选择超全指南之抗体小知识》和抗体选择基本原则《一文读懂抗体选择，建议收藏！》，今天就WB实验举例手把手教你选择合适的抗体，咱们开始吧~

案例一WB检测原代人胰岛细胞siRNA敲降FKBP5后pAKT^ser473蛋白的表达情况

1.选择一抗

该一抗需满足三要素：

目的蛋白：内源性的磷酸化AKT（Ser473）

检测样本种属：人

实验方法：WB

依照我们在《一文读懂抗体选择，建议收藏！》中介绍的基本原则，以上这个抗体#4060无论是检测的靶标、实验方法、反应种属以及灵敏度都满足需求，并且这个抗体已发表文献10478篇，是非常经典热销的产品，所以就选择它了。

 

需注意的是，在检测磷酸化蛋白时，总蛋白和内参都需要做，因磷酸化水平的变化需要用磷酸化蛋白与总蛋白比值变化来判定，所以要同时购买AKT总蛋白的抗体，同理经过筛选后我们选择了#9272，以及内参beta-actin #abs119600。

 

一抗选择小心机：一抗尽量选择同一来源的，二抗可通用哦~

2.选择二抗

普通的WB实验，二抗可选择普通形式的，即名称包含anti-IgG(H+L)的，（还记得H+L代表什么意思吗?不记得的话可以去《抗体选择超全指南之抗体小知识》补课哦），这类产品适用性广且价格便宜。因#111-035-144稀释比例非常高，做WB最高可达1:200000，性价比高，所以优先选择了它。

3.选择结果

结果出炉，就是这么简单，你get到了吗？

选择目标	货号	来源	产品名称
磷酸化一抗	4060	Rabbit	Phospho-Akt(Ser473)(D9E)XP® Rabbit mAb
总蛋白一抗	9272	Rabbit	Akt Antibody
内参	abs119600	Rabbit	Rabbit anti-β-Actin Polyclonal Antibody
二抗	111-035-003	Goat	Peroxidase-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)

案例二荧光WB如何选择二抗？

有小伙伴实验室做的是近红外荧光WB，那么应该如何选择抗体呢？其实荧光WB一抗的选择和普通WB没有区别，只是不再使用传统的HRP标记的二抗，而是使用近红外染料标记的二抗结合特异性一抗，无需使用胶片和显影液。

 

Alexa Fluor®680和Alexa Fluor®790都是近红外染料，除了这两种染料标记的二抗之外，很多厂家也推出其他的近红外染料标记二抗，若说明书写明适配了您的仪器平台，那么根据需求选择即可，以下是部分热卖的近红外染料标记二抗：

Alexa Fluor ® 790

Alexa Fluor ® 680 

案例三IP后的WB如何选择抗体？

如果IP和WB一抗来源（Host/Source）相同，IP后沉淀含有目的蛋白和IP抗体，在高温金属浴及还原剂的作用下，IP抗体发生发生变性，断裂为游离的重链（~50kDa）和轻链（~25kDa） 。后续做WB若使用前述的常规Anti-IgG(H+L)的酶标二抗，会同时识别原先的IP抗体和WB抗体，导致膜上至少出现三条不同的带，那么如何解决这个问题呢？

解决方案一：WB一抗与IP一抗选择不同种属来源，此时选择普通二抗即可。

解决方案二：WB选用HRP偶联一抗，无需二抗。

解决方案三： 选用构象特异性或链型特异二抗，以避免重链和/或轻链的干扰。

构象特异性二抗，仅识别空间构象表位，高温变性的抗体失去了原有的空间构象，不会被识别，因此不会产生重链（~50kDa）和轻链（~25kDa）的条带。

 

当目标蛋白位于50kDa分子量附近时，可选择抗轻链的二抗，不识别重链，不会产生重链（~50kDa）的条带。

 

当目标蛋白位于25kDa分子量附近时，可选择抗重链端的二抗，不识别轻链，不会产生轻链（~25kDa）的条带。

货号	种属来源/对应一抗种属（标记）	轻/重链特异性
93702	Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (HRP Conjugate)	抗轻链特异性，避免重链干扰
58802	Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate)	抗轻链特异性，避免重链干扰
115-035-008	HRP-Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Secondary Antibody	抗重链特异性，避免轻链干扰
111-035-008	HRP-Goat Anti-Rabbit IgG, Fc Secondary Antibody	抗重链特异性，避免轻链干扰
5127	Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate)	同时避免轻&重链干扰

注：文章内容来源于小优大学堂讲座《抗体选择超全指南》，欢迎点击此处观看讲座视频。

 

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