表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）是抗肿瘤领域最经典的靶点了，小优细节君每次看相关文献的引用数，都高的离谱，足可见其热门程度，还有那些叫“XX替尼”的药物都是针对该靶点的药物。大数据显示EGFR的WB并不好做，今天小优细节君就和大家一起讨论一下。

在这之前，我们先来复习一下什么是EGFR：

EGFR是一种广泛分布于细胞膜表面的跨膜酪氨酸激酶受体，属于ErbB受体家族成员。其结构包含胞外配体结合域、跨膜结构域及胞内酪氨酸激酶活性域，主要通过与表皮生长因子（EGF）等配体结合后被激活，触发下游信号通路，如RAS/MAPK、PI3K/AKT等，调控细胞增殖、分化、迁移和存活等关键生理过程。EGFR的异常活化（如过度表达、基因突变或配体非依赖性二聚化）与多种癌症（如非小细胞肺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤）的发生发展密切相关，尤其EGFR突变体（如EGFRvIII、L858R、T790M）已成为靶向治疗重要标志物。

   图1 EGFR信号通路

接下来我们就来看下WB有哪些注意事项：

样本制备

从前面的介绍我们知道EGFR是一种跨膜蛋白，所以在提取蛋白的时候建议使用SDS裂解液，或者强RIPA裂解液，否则很难将EGFR蛋白从膜提取出来，裂解液最好配合超声处理，使蛋白溶出更加充分。

在选择研究样本的时候一定要提前查阅样本的表达量，虽然说肿瘤细胞普遍表达，但是表达量有高有低。如果表达未知的情况下，最好是增加阳性对照来帮忙判断，A431细胞是公认的高表达的细胞系，如果没有，也可以使用Hela细胞替代。

EGFR会形成同源二聚体或者异源二聚体，制样的时候务必添加足量的还原剂，DTT或者BME，将二硫键打断，否则更大的聚体很难跑下来。DTT或者BME都属于不稳定的物质，loading buffer时间长了都需要重新添加以保证效果。

图2 EGFR在A431等细胞表达情况

分子量

EGFR理论分子量是134kd，由于糖基化修饰，大部分样本跑出来的表观分子量都在175kd左右，所以裁膜的小伙伴要注意了，不要把目的蛋白区间给裁掉。由于是大分子量蛋白，电泳建议使用6%/8%的胶或者梯度胶，尽量把大分子量区域分开些。转膜条件也要稍微改变下，大分子量推荐恒流转，200-250mA转2.5h，转膜液中的甲醇浓度可以降低至5%-10%，若转膜效果不佳，可适当添加0.1%SDS。

抗体选择

有的小伙伴做之前会查阅Uniprot数据库，这是一个非常好的习惯。对于EGFR来说，研究其磷酸化是必不可少的，但是关于磷酸化位点，好多小伙伴就产生了疑惑，为什么按照Uniprot的磷酸化位点找不到对应的抗体？小优细节君来解答一下，这是个历史遗留问题了，因为EGFR磷酸位点的发现在信号肽的发现之前，人们先报道了磷酸化位点和对应的氨基酸，后面才发现原来N端还有24个氨基酸的信号肽，而信号肽在EGFR运输到膜后就被酶切掉了。后来大家为了保持该领域的一致性，将错就错，还是以最初报道的氨基酸位点为准，这就是差异的原因，所以我们要将Uniprot的磷酸化位点-24去查询对应的抗体。

还有些小伙伴做的是EGFR的突变体EGFRvIII，常表达在多种恶性肿瘤中，那么手头上的EGFR抗体能否识别EGFRvIII呢？我们得知道EGFRvIII缺失的是6-273的氨基酸，所以如果免疫原序列在这区间的EGFR抗体，就没办法识别了，只能买EGFRvIII特异性抗体了。小优细节君也帮大家问过，CST#4267是可以识别EGFRvIII的。

细胞定位

EGFR通常位于细胞膜表面，但是在某些特定条件下，可以通过内吞机制转运到细胞核内，激活转录活性。我们在做WB的时候，可以保留核蛋白，或者尽可能完全裂解全细胞蛋白。如果做免疫荧光之类的定位实验，发现核里有EGFR的阳性染色，也不要简单认为是非特异染色，可能就是入核的EGFR。这个入核的EGFR也被认为是许多EGFR抑制剂耐药性的原因之一。目前尚无特异性靶向核内EGFR的药物获批用于临床，如果小伙伴们发现某种药物可以有效改变核内的EGFR表达情况，就是全新的治疗方法了。

图3 EGFR的核易位

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参考资料：

1. Nina S, Dmitri K, Aleksandra E, et al. Targeted Inhibitors of EGFR: Structure, Biology, Biomarkers, and Clinical Applications. Cells, 2023 Dec 25;13(1):47.

2. An Z, Aksoy O, Zheng T, et al. Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies. Oncogene. 2018 Mar;37(12):1561-1575.

3. Brand TM, Iida M, Luthar N, et al. Nuclear EGFR as a Molecular Target in Cancer. Radiother Oncol. 2013 Sep;108(3):370-7.