巨噬细胞作为免疫系统中具有吞噬作用的细胞，在炎症反应，代谢，自身免疫性疾病和癌症中扮演重要的角色。巨噬细胞根据功能可以分为M1型和M2型两种亚群。M1巨噬细胞主要由LPS及IFNγ激活，分泌IFN-γ、TNF-α等促炎症因子；M2巨噬细胞主要由IL-4、IL-13、M-CSF等激活，主要分泌IL10等抗炎症因子。今天我们讨论的主角CD206就是M2型巨噬细胞的一个常用标志物，具有高度特异性[1]。

我们先来了解什么是CD206，CD206即甘露糖受体（Mannose receptor，MR），是一种钙依赖性Ⅰ型跨膜蛋白，具有多个胞外结构域，能识别和结合广泛的内源性和外源性配体，在维持内稳态、识别病原、诱导细胞因子、抗原递呈等过程中发挥重要作用。

那么我们在WB检测中怎样才能获得理想的CD206条带呢？今天小优细节君总结了一些实验关键点和大家一起探讨，一起来学习吧~

01.确定样本表达量

CD206（Mannose Receptor）主要在巨噬细胞和树突状细胞中表达，也在淋巴、肝和脾内皮、肾系膜细胞、气管平滑肌细胞和视网膜色素上皮中表达。在选择特定样本进行研究时，可以提前查阅相关文献或数据库确定蛋白表达量。如果没有相关数据，也可选择一个表达量高的细胞或组织作为阳性对照，例如肺，肝组织。

图1 THE HUMAN PROTEIN ATLAS中MRC1在各组织中的表达量

图2  CD206/MRC1 (E6T5J) XP® Rabbit mAb #24595 官网例图

02.适当的刺激处理

如上面提到的，CD206是M2型巨噬细胞的标志物，那么在检测时，诱导巨噬细胞向M2型分化极其重要。RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）是体外炎症模型常用的细胞之一，在细胞培养基中加入IL-13和IL-4等刺激处理，诱导巨噬细胞向M2型极化。同时M2型巨噬细胞的标志物还有Arg-1和CD163等，在实验中可以同时检测这些蛋白结合判断刺激处理是否成功。

图3  巨噬细胞的类型

Tips：巨噬细胞标志物

03.样本制备

在WB实验中，好的样本制备是实验成功的一半。CD206作为一个跨膜蛋白，样本制备的好坏对结果的影响至关重要。对于跨膜蛋白，裂解液不推荐使用RIPA，RIPA可能无法充分裂解膜蛋白，导致蛋白丢失，WB检测不到。膜蛋白裂解液更推荐Laemmli缓冲液，且需在裂解液中添加足够的蛋白酶和磷酸酶抑制剂，裂解全程要在冰上操作，避免蛋白降解。其次就是变性，膜蛋白变性不建议煮沸，可能会引起蛋白的聚集或膜蛋白降解，一般建议70℃，10min或37℃，30min。对于上样量，细胞样本建议上样20-50ug/泳道，组织样本建议上样80-100ug/泳道。

Ps：其他更多膜蛋白提取的细节可以查看我们之前的文章：【小优细节君】离子通道蛋白如何做好WB？

04.糖基化修饰

CD206是一个高度糖基化的蛋白，小鼠源中携带 7个潜在的 N-糖基化位点，在人源中携带 8个潜在的N-糖基化位点，可能还有多个O-糖基化位点[2]，它能够通过调节糖基化来调节其功能。这也可能导致不同组织/细胞中糖基化程度不同，功能不同的原因之一[3]。CD206的预测分子量为160Kda，因其高度糖基化的特点，在WB实验中通常会在200Kda附近观察到靶标蛋白条带，这就提示我们在WB检测时抗体要全膜孵育，或在转膜时将膜裁宽一点，避免目的信号丢失。

其次，作为一个分子量较大的蛋白，在WB实验中建议使用6%的分离胶或4-15%的梯度胶，延长电泳时间，确保大分子蛋白Marker充分跑开，转膜建议应用恒流200-250mA，时间2-3h，转膜期间全程保持低温，同时可以降低转膜液中甲醇浓度至5~10%，额外添加0.1%SDS，确保转膜成功。

以上就是小优细节君对CD206WB检测的一些建议，希望您在实验遇到问题时可以参考帮您改善实验，与君共勉~

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参考资料：

[1] 李悦,高磊,李红昌,等. M2型巨噬细胞标志物CD206与肿瘤.国际肿瘤学杂志,2019，46(03) : 174-177. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-422X.2019.03.009

[2] Stavenhagen K. et al. “N-glycosylation of mannose receptor (CD206) regulates glycan binding by C-type lectin domains”. J Biol Chem. 2022 298(12):102591. DOI: 10.1016/j.jbc.2022.102591

[3] Su Y. et al. “Detailed N-glycan analysis of mannose receptor purified from murine spleen indicates tissue specific sialylation”. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009; 384: 436–443. DOI: 10.1016/j.bbrc.2009.04.159