巨噬细胞培养攻略 - 北京螽斯羽

巨噬细胞（Macrophages，mø）作为先天免疫的核心成员，可以通过吞噬作用清除病原体、死亡细胞和异物；同时具备抗原呈递功能，将处理后的病原体片段呈递给T细胞，启动适应性免疫应答。不仅如此，巨噬细胞还能够在特定组织中分化成功能不一的组织驻留巨噬细胞：如库普弗细胞（肝脏）、小胶质细胞（脑部）等。

接下来小优会从巨噬细胞来源-诱导分化与培养-鉴定-热门研究四个方面带大家通关不同来源的NK细胞培养！之前小优也给大家介绍了《免疫卫士-T细胞培养攻略》、《DC细胞培养攻略》、《B细胞培养攻略》、《NK细胞培养攻略》小伙伴们按需查看呦~

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巨噬细胞来源

在骨髓中，造血干细胞分化为单核细胞前体细胞（MDCP），再进一步分化为两种单核细胞亚群，即Ly6C+CX3CR1loCCR2+CD62L+和Ly6CloCX3CR1hiCCR2−CD62L−。这两种单核细胞均可以通过CCR2和MCP-3信号传导被动员至血液，一旦进入血管，单核细胞就可以通过血管外渗离开血管，并通过CCR2和CX3CR1信号传导到达组织成为各具特点的组织驻留巨噬细胞[1]。所以体外培养的巨噬细胞来源可以是实体组织（骨髓、脾脏、肝脏、淋巴结等）、血液、直接购买商品化的原代单核/巨噬细胞（4W-400）或单核/巨噬细胞系（THP1、Raw264.7等）。具体样本制备和细胞分选的内容，小伙伴们可以参考之前的文章：《免疫细胞培养通关技巧之样本制备》和《免疫细胞培养通关技巧之细胞分选》。

巨噬细胞发育[1]

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小鼠脾脏组织解离试剂盒，高效制备单细胞悬液

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用作心脏、骨、肝、甲状腺、唾液腺和软骨等组织的原代细胞制备

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用于消化胰岛细胞以及对细胞表面受体完整性有较高要求的实验样本

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快速温和地从淋巴组织和非淋巴组织的单细胞悬液中分离小鼠巨噬细胞

巨噬细胞诱导分化与培养

巨噬细胞分化是科学研究中很重要的一部分，由于巨噬细胞的可塑性，未分化的巨噬细胞（M0）分化为两种类型：经典活化巨噬细胞（M1）和交替活化巨噬细胞（M2）。M1应对LPS、IFN-γ等刺激，分泌大量的促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β等），发挥促炎、抗菌功能；而M2应对 IL-4、IL-13等刺激，分泌大量的抗炎细胞因子（IL-10、IL-1RA等），发挥抗炎、促进伤口愈合的作用[2]。

巨噬细胞分化[2]

体外实验中也可以通过添加上述刺激物诱导单核/巨噬细胞的分化，接下来，小优会从原代单核/巨噬细胞（单核来源的巨噬细胞、骨髓来源的巨噬细胞）、单核/巨噬细胞系（THP-1、U-937、Raw264.7、J774a.1）诱导分化与培养两个方面为大家详细介绍：

一、原代单核/巨噬细胞诱导分化

01单核来源的巨噬细胞（Monocyte Derived Macrophage，MDM）分化成M1、M2[3]

单核来源的巨噬细胞由外周血单核细胞经GM-CSF或M-CSF诱导分化而来，具有较强异质性，可模拟炎症状态下单核细胞向组织迁移分化的过程，常用于研究感染、肿瘤等病理环境中的巨噬细胞功能。

①使用FICOLL PAQUE PLUS 1.077（17144003-1）从人的外周血中提取PBMC；

②使用CD14 MicroBeads, human（130-050-201）磁珠分选CD14+单核细胞；

③使用完全培养基（RPMI1640（SH30809.01）+10%FBS（SV30208.02）+1%PS（SV30010））重悬单核细胞，并以5*10^5/ml接种于12孔板，加入20 nM M-CSF（UA040128）;

④培养7天，每3天更换一次培养基并添加M-CSF，即可获得MDM（M0）；

⑤M1分化：向上述M0细胞中加入1 μg/ml LPS（abs47014848-5mg）和10 ng/ml IFN-γ（UA040065）培养48h；

⑥M2分化：向上述M0细胞中加入20 ng/ml IL-4（UA040192）和5 ng/ml IL-13（UA040158）培养48h。

02骨髓来源的巨噬细胞（Bone Marrow Derived Macrophage，BMDM）分化成M1、M2[4]

骨髓来源的巨噬细胞由骨髓前体细胞经M-CSF培养获得，分化均一性高，增殖能力强，适合体外大规模实验，广泛应用于基础免疫研究及药物筛选。

① 处死小鼠后分离股骨和股骨，使用含2%FBS（SV30208.02）的PBS（SH30256.01）冲洗小鼠骨髓腔，收集冲洗液后反复吹打骨髓悬液，70 μm筛网（abs7232）过滤去除碎骨和团块；

②使用完全培养基（IMDM（SH30228.01）+10%FBS（SV30208.02））重悬骨髓细胞，并以2*10^6/ml接种于12孔板，加入10 ng/ml M-CSF（216-MCC-025/CF）；

③培养7天，每3天更换一次培养基并添加M-CSF，即可获得BMDM（M0）；

注意：在第7天，可通过流式细胞术评估成熟BMDM（CD11b+F4/80+）的形成。

④M1分化：向上述M0细胞中加入100 ng/ml LPS（abs47014848-5mg）和50 ng/ml IFN-γ（285-IF-100/CF）培养48h；

⑤M2分化：向上述M0细胞中加入10 ng/ml IL-4（404-ML-010/CF）和10 ng/ml IL-13（285-IF-100/CF）培养48h。

小鼠BMDMs的分离、形成和刺激方案[4]

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CD11b Antibody, anti-mouse, PE, REAfinity™ 130-113-806

F4/80 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity™ 130-117-509

二、单核/巨噬细胞系诱导分化

01：THP-1分化成M0、M1、M2[3, 5]

THP-1：人单核细胞白血病细胞系，可经PMA（佛波酯）诱导分化为巨噬细胞样细胞，常用于研究炎症、免疫调控及肿瘤相关巨噬细胞的功能，适合模拟人源单核/巨噬细胞响应。

①使用完全培养基（RPMI1640（SH30809.01）+10%FBS（SV30208.02）+1%PS（SV30010）+0.05mM β-巯基乙醇（abs9592-100mL））重悬THP-1细胞，并以5*10^5/ml接种于12孔板，加入100 ng/ml 佛波酯PMA（abs9107-5mg）,培养48h，即可获得M0细胞；

②M1分化：向上述M0细胞中加入100 ng/ml LPS（abs47014848-10mg）和20 ng/ml IFN-γ（abs04123-50ug）培养48h；

③M2分化：向上述M0细胞中加入20 ng/ml IL-4（abs04698-100ug）和20 ng/ml IL-13（abs00816-10ug）培养48h。

02：U-937分化成M1、M2[6]

U-937：人淋巴瘤来源的单核细胞系，也可通过PMA分化为巨噬细胞，但分化效率低于THP-1，多用于病毒侵染、免疫代谢及肿瘤微环境研究。

①使用完全培养基（RPMI1640（SH30809.01）+10%FBS（SV30208.02）+1%PS（SV30010））重悬U-937细胞，并以2*10^6/ml接种于12孔板，加入100 ng/ml 佛波酯PMA（abs9107-5mg）,培养48h，移除PMA后，可静置培养48–96小时，以形成稳定M0表型；

②M1分化：向上述M0细胞中加入10 ng/ml LPS（abs47014848-10mg）和10 ng/ml IFN-γ（UA040065）培养48h；

③M2分化：向上述M0细胞中加入25 ng/ml IL-4（UA040192）和25 ng/ml IL-13（UA040158）培养48h。

03：Raw264.7分化成M1、M2[7]

RAW 264.7（相当于M0）：Raw264.7：小鼠白血病来源的巨噬细胞系，无需诱导即可直接培养，增殖快且易转染，广泛用于炎症信号通路（如NF-κB）、吞噬功能及脂代谢研究。

①使用完全培养基（DMEM（SH30243.01）+10%FBS（SV30208.02）+1%双抗（SV30010））重悬RAW264.7细胞，并以2.5*10^5/ml接种于12孔板；

②M1分化：向上述RAW264.7细胞中加入100 ng/ml LPS（abs47014848-5mg）培养24h；

③M2分化：向上述RAW264.7细胞中加入20 ng/ml IL-4（404-ML-010/CF）培养24-48h。

04：J774A.1分化成M1、M2[8]

J774A.1（相当于M0）：小鼠巨噬细胞系，具有较强吞噬活性，常用于细菌感染、泡沫细胞形成及细胞因子分泌研究，但分化特性较原代巨噬细胞弱。

①使用完全培养基（RPMI1640（SH30809.01）+10%FBS（SV30208.02）+1%PS（SV30010））重悬J774A.1细胞，并以1*10^5/ml接种于12孔板；

②M1分化：向上述J774A.1细胞中加入100 ng/ml LPS（abs47014848-10mg）培养24h；

③M2分化：向上述J774A.1细胞中加入5ng/ml IL-13（abs00816-10ug）培养24h；

温馨提示：关于单核巨噬细胞的培养要点，大家可以看《Raw264.7、THP1、MH-S、J774A.1，单核-巨噬细胞系培养合集来袭！》这篇文章。

小优也汇总了上述来源的巨噬细胞体外诱导分化方案，可供参考~

巨噬细胞鉴定

巨噬细胞亚型（M1、M2）鉴定最常用的方法是流式，关于流式鉴定的基本内容大家可以参考《免疫细胞培养通关技巧之分型鉴定》。常用的巨噬细胞标记物包括CD11b、CD14、CD16、CD68、F4/80（小鼠）。CD80和CD86常用作M1型巨噬细胞标记物，而CD163和CD206则为M2型巨噬细胞的标志。

另外需要注意的是，巨噬细胞具有异质性，比如在小鼠的不同组织中，巨噬细胞对应检测指标不同，大家可以参考下表。

小鼠组织驻留巨噬细胞对应标记物及功能[9]

除了流式细胞术，还可以使用qRT-PCR确定激活的M1和M2巨噬细胞特征基因的表达，包括IL-1β、TNF-α和IL-6（M1激活）或IL-10、IL-13、arginase1和PPARγ（M2激活）；或者通过Western blot分析确定参与M1或M2巨噬细胞激活的细胞信号通路的激活。

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CD11b Antibody, anti-mouse, REAfinity™ 130-113-811

CD14 Antibody, anti-human, PE-Vio® 670, REAfinity™ 130-132-896

CD16 Antibody, anti-human, PE, REAfinity™ 130-113-393

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F4/80 Antibody, anti-mouse, Vio® R667, REAfinity™ 130-131-632

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CD163 Antibody, anti-human, APC, REAfinity™ 130-112-129

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Trizol abs60154-100mL

One-Step RT-PCR Kit abs60074-200T

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巨噬细胞热门研究

巨噬细胞的热门研究也非常多，比如巨噬细胞的功能和调控机制、巨噬细胞与免疫逃逸、巨噬细胞与代谢（糖酵解、代谢重编程）等。例如《25-Hydroxycholesterol regulates lysosome AMP kinase activation and metabolic reprogramming to educate immunosuppressive macrophages》发现了一个新的巨噬细胞免疫代谢检查点：CH25H（胆固醇-25-羟化酶）。TAMs中CH25H的表达增加，导致25HC（CH25H）在溶酶体中积累。25HC通过与GPR155-mTORC1复合体相互作用，抑制mTORC1，激活AMPKa，进而磷酸化STAT6，增强其活性，促进ARG1产生，增强TAMs的免疫抑制功能。另外，CH25H缺失的巨噬细胞可将“冷肿瘤”转变为“热肿瘤”，提高抗PD-1疗法的抗肿瘤效果。研究还表明，25HC促进氧化磷酸化和线粒体功能，进而使巨噬细胞向免疫抑制亚群分化。因此：靶向CH25H可改善抗肿瘤免疫反应，为肿瘤治疗提供新策略。