IL-1β作为重要的促炎细胞因子，在炎症反应、免疫调节、肿瘤发生发展等生理病理过程中发挥关键作用。近年来研究发现，IL-1β在不同疾病状态下的表达差异、转化调控机制与疾病进程密切相关。例如，在阿尔茨海默病患者大脑中，IL-1β前体的异常积累与神经炎症和神经元损伤相关；在肿瘤微环境中，IL-1β成熟体的高表达可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[1, 2]。深入研究IL-1β前体及成熟体的表达与功能，对于理解疾病发生机制和开发靶向治疗策略具有重要意义。然而在WB实验中，IL-1β的检测却时常让人心力交瘁，无条带、分子量不对等问题仿佛家常便饭。如何才能提高成功率，得到理想的条带呢？今天小优就来分享一下IL-1β的WB检测经验。
蛋白结构与特点
IL-1β前体（pro-IL-1β）由311个氨基酸组成，分子量约31 kDa。其N端包含一段信号序列，该序列在蛋白转运与定位过程中发挥作用，但不参与成熟体的形成。pro-IL-1β没有明显的分泌信号肽，需通过非经典分泌途径释放到细胞外[3]。IL-1β剪切体（cleaved-IL-1β）由193个氨基酸组成、分子量约17.5 kDa。炎症小体激活是IL-1β前体向剪切体转化的关键环节。在炎症刺激下，pro-IL-1β被caspase-1特异性识别并切割，去除N端116个氨基酸，形成cleaved-IL-1β[4]。
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Fig.1 IL-1β的形成与剪切
此外，非经典炎症小体通路也参与这一过程，例如由caspase-4/5/11介导的对细菌脂多糖（LPS）的响应，同样可导致IL-1β前体的剪切激活。
pro-IL-1β在细胞内主要作为成熟体的储备形式，自身生物学活性有限，在细胞内相对稳定；而成熟体可通过与IL-1受体结合，激活下游信号通路，引发炎症反应。成熟体由于暴露了活性结构域，更容易被蛋白酶降解，且成熟体分泌到细胞外后，也面临着复杂微环境中各种因素的影响。
IL-1β前体和成熟体的形成和特点均影响着他们的性质，所谓知己知彼，百战不殆。下面我们就一起来看看在WB检测中如何扬长避短，将难点一一攻克。
实验细节
01样品制备
a. 合适的诱导刺激
所有有核的细胞都能合成和分泌，但最主要是由活化的单核细胞和巨噬细胞产生。由于IL-1β转录受NF-κB、AP-1等多种转录因子调控，而成熟体的生成则依赖caspase-1等蛋白酶的激活。不同刺激因素、细胞类型会导致前体及成熟体表达的差异。因此需要我们根据细胞类型和研究目的，选择合适的刺激物和刺激时间进行处理，以期成功诱导IL-1β前体表达和成熟体生成。如THP-1细胞使用100 ng/mL的LPS处理3 hr，可以诱导pro-IL-1β表达。另外也可以查阅相关资料和文献，并通过预实验摸索最佳刺激条件，以获得理想的表达水平。
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Lane 1: untreated THP-1 cells
Lane 2: LPS-treated (100 ng/mL, 3 hr) THP-1 cells
Fig.2 诱导刺激对pro-IL-1β的影响
b. 使用分泌抑制剂/浓缩培养基
IL-1β活化后会分泌到胞外，因此在检测成熟体形式时，可以使用分泌抑制剂如Brefeldin A）处理细胞，抑制IL-1β分泌到细胞外。或者同时收集培养基并浓缩进行检测。另外，也要留意细胞培养密度的一致性，偏低或过高的细胞密度都会影响包括IL-1β在内的细胞因子分泌。
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Lane 1: Untreated RAW 264.7 whole cell lysate
Lane 2: RAW 264.7 treated with 100 ng/ml LPS for 6 hours, then with 300 ng/ml BFA added after 3 hours whole cell lysate
Fig.3 抑制剂对cleaved-IL-1β的影响
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cell extracts and media from mBMDM untreated (-), or treated (+) with combinations of LPS (50 ng/ml, 4 hr) followed by nigericin (15 uM, 45 min)
Fig.4 细胞裂解液与浓缩培养基中cleaved-IL-1β的对比
02样品制备
IL-1β的分子量不大，并且前体与成熟体之间分子量之差仅有14 kDa，因此选择合适的分离胶浓度对于跑出漂亮的条带就至关重要了。建议使用12%及以上或4%-20%的分离胶，提高分辨率。同时建议使用0.22um的膜进行转印，转印完成后，可用丽春红染色验证转膜效果。
03设置对照组
实验时可以设置阳性对照（如LPS刺激后的细胞样品）、阴性对照（未刺激的细胞样品）和空白对照（仅加二抗，不加一抗的样品）组。通过对照组的实验结果，判断条带的特异性，排除非特异性结合和实验操作误差对结果的影响。
04上下游蛋白检测
通过检测同一调节通路中，IL-1β的上下游蛋白的结果，可以辅助判断通路的激活情况进而推测IL-1β的表达水平。
05ELISA实验验证
如进行WB 实验一直无存在无条带或条带很弱的情况，可以换个思路。通过ELISA实验进行检测。一般来说ELISA实验的灵敏度高于WB，如样本中的IL-1β含量低于WB实验的检出限，则可以通过ELISA实验进行验证。
IL-1β前体及成熟体在WB实验检测中存在诸多挑战，通过深入了解其特性，针对实验难点采取相应的解决方案，严格规范实验操作，相信大家一定能够提高检测的准确性和可靠性，为揭示IL-1β相关的生物学机制和疾病病理过程提供有力的数据支持。
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参考文献
[2] Grivennikov SI, Greten FR, Karin M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 2010 Mar 19;140(6):883-99. doi:10.1016/j.cell.2010.01.025. PMID: 20303878; PMCID: PMC2866629.
