新手必读！IHC/ICC/IF抗体选择宝典，实验不走弯路！

哈喽大家好呀，一转眼咱们的《抗体选择超全指南》专题来到了第四期，前面小优给大家介绍了《抗体选择超全指南之抗体小知识》、抗体选择基本原则《一文读懂抗体选择，建议收藏！》、《手把手教你精准选择WB实验抗体》，今天，小优带大家看看如何选择IHC/ICC/IF的抗体，这个部分需要注意的地方还是挺多的哦~

根据《一文读懂抗体选择，建议收藏！》中介绍的基本原则，按照目的蛋白、检测种属及实验方法三要素选择即可，前面咱们也提到过，选择免疫组化的抗体的时候，需要注意样本是石蜡切片、冰冻切片还是细胞爬片，每个公司对IHC，IHC-P等等这些标注的解释可能都不太一样，不熟悉的同学可以翻到前面再复习一下哦~

图1-2：S0B2051说明书

选择产品：SOX2 Recombinant Rabbit mAb(SDT-066-58) （货号：S0B2051）

一抗兔来源的，所以二抗选择抗兔的。普通IHC/ICC推荐全长（H+L）的二抗，然后根据实验室的显色系统选择标记物（HRP或Biotin）。

选择产品：Goat anti-Rabbit IgG-HRP Antibody（货号abs20040）

另外，也可选择即用型高效免疫组化二抗试剂盒（货号abs957），一个盒子包含二抗、底物及封闭液等等，还有一抗放大剂，提高检测的灵敏度，一抗可再稀释2-4倍，不仅可以节省一抗，背景也更低，整个操作流程也非常快速便捷，目前产品已经发表文献107篇，最高IF:17.5，是一款认可度非常高的产品哦！

推荐二抗形式：F(ab') ₂ 片段抗体，降低二抗Fc端的非特异性结合

F(ab')₂片段抗体是用胃蛋白酶消化IgG去除Fc部分，剩下两个靠二硫键连接的结合抗原的Fab，它能降低二抗Fc端的非特异性结合。

建议使用预吸附二抗，以降低二抗与内源性 Igs 发生交叉反应的风险。

举例：对大鼠组织（含有大量内源性Igs）进行染色时，使用针对大鼠进行预吸附处理的二抗。

图3：一抗与所研究组织种属来源相同时的检测对比

AffiniPure™ Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)

货号115-007-003

AffiniPure™ Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)

货号111-007-003

 图4：常用荧光素颜色及通道

表1：常用荧光配色举例

在同一样本上需要同时检测两种抗原时，需进行免疫荧光双染，有直接法和间接法两种。

使用两种不同荧光素的直标抗体

特点：简便可靠，不需要考虑一抗种属来源不同的问题，但不使用二抗，没有信号放大效应，灵敏度较低。

两种未标记的一抗 + 两种不同的荧光素分别标记的二抗

特点：灵敏度较高，需要考虑一抗种属来源的问题，荧光标记二抗的种属必须与一抗的种属相匹配。

两种特异性一抗来源于不同种属时，建议使用预吸附二抗，减少非特异性结合；

两种特异性一抗来源于相同种属时，需使用Fab形式二抗。若检测的指标XY均为间标，X的二抗选用Fab形式，可同时封闭X一抗的所有二抗结合位点，之后Y可选用普通的一抗和二抗；当X使用了直标一抗时，需先使用Fab片段二抗封闭X一抗的二抗结合位点，之后Y再使用普通的一抗和二抗。

图5：一抗来源相同的免疫荧光双染

如果要做三色的免疫组化，有以下几个注意点:

图6：多重荧光免疫组化抗体选择举例

如果您做4种或更多指标的mIHC，建议使用经典的TSA或新兴的SignalStar技术，不需考虑抗体选择问题，实验设计更轻松！详见《6小时完成8指标染色？！mIHC技术大盘点》

好了，今天的介绍就到这里结束了，我们下期再见！

注：文章内容来源于小优大学堂讲座《抗体选择最全指南》，点击此处观看讲座视频