【单细胞测序系列】只做转录组不做蛋白组，意义少一半？
很多人可能考虑科学研究中，是做WTA，还是做蛋白组，还是都做呢？看过今天小优分享的一篇文献【通过单细胞基因组学捕获的COVID-19患者免疫细胞的全转录组分析(WTA)和表面标记表达(AbSeq)动态】或许你会有新的看法。
一
实验简介
二
实验思路框架
健康、SARS CoV-2感染和恢复的样本分为三组，工作流程原理图如上，然后进行WTA和AbSeq的文库制备和scRNA测序。
1、样本制备
外周血采集&运输：单个细胞制备准备管 CPT cell preparation tubes (Becton, Dickinson and Company, United States, Catalog no: 362753)
PBMC制备&获得：（点击可查看具体PBMC操作细节）
样本混样：多个样本混合处理2×10^5 cells per sample，采用BD Rhapsody的混样试剂盒（BD single cell multiplexing kit-human,Catalog no：633781）
不同样本通过Sample Tag标记后，可混合检测
2、Cell Surface Marker染色
带有oligo寡核苷酸的抗体能够在单细胞测序实验中同时检测蛋白质和mRNA表达，有助于加深对蛋白质生物学的理解，并加速单细胞研究。
40个指标选择意义
3、RNA捕获、文库、测序
三
实验结果说明
1、mRNA cell map细胞图谱结果
从三类样本健康、COVID-19 感染者和康复者收集到的 124,726细胞，通过T-SNE做可视化分析，分成了17个不同免疫群。
通过柱状图，将17个免疫亚群在三类不同来源样本（健康、COVID-19 感染者和康复者）做了比例说明。
2、mRNA转录组检测与Ab Seq检测差异
在39个基因中观察到四种不同的模式
基因表达包含两个基本阶段：转录和翻译，理论认为 RNA 和蛋白质水平之间存在很强的相关性。但是在本篇实验同时做了WTA和蛋白水平检测（D-H结果），如上发现这一说法并不准确。
3、哪些指标差异较大？
mRNA 和蛋白质水平之间的差异有四种模式：
●第一组表面标志（CD38、CD28、CD69、CD14、FCGR3A、ENTPD1、SELL、FAS、CXCR4、ITGA4和CD19）表现出与相应 mRNA 表达相似的表达模式。
●第二组表面标志（CD4、CD8A、CD5、HAVCR2、CD40LG、CD27、CD7、GITR和CD40）在健康组中表现出与 WTA 对应物相反的表达模式，但在其他组中具有相似的表达模式
●第三组表面标志（TRDC、CCR7、PTPRC、LAG3、IL2RA、CCR5、PDCD1、PTGDR2、CXCR3、CCR4和IL7R）在恢复组中表现出与 WTA 对应物相反的表达模式，但在其他组中具有相似的表达模式。
●第四组：8 种表面标志（CXCR5、CR2、NCAM1、KLRB1、CD3E、CTLA4、TRAC和CD74) 在三组中的表达模式与 WTA 对应物完全相反。
总体而言，约 72% 的表面标志物显示不一致，而其余 28% 与其相应的 mRNA 表达一致。
4、哪些免疫细胞差异较大？
(A)树突状细胞 (DC)、经典单核细胞 (CM)、自然杀伤 (NK) 细胞、自然杀伤 T 细胞 (NKT)、辅助 T 细胞 1 和辅助 T 细胞 2 中特定标志物的高表达是健康个体中细胞身份标志物和辅助受体表面标志物表达升高的主要原因，如图右侧突出显示。
(B)细胞类型包括 CD4 + T 效应记忆细胞、经典开关记忆 B (CSMB) 细胞、树突状细胞 (DC)、幼稚 B 细胞、幼稚 CD4 + /CD8 + T 细胞、浆母细胞、自然杀伤细胞以及辅助 T 细胞 1 和辅助 T 细胞 2。这些细胞群共同促进了细胞活化标志物的表达升高，并表现出 mRNA 和蛋白质水平之间的一致性。
(C)活化的 CD4 +细胞、CD4 + T 中央记忆细胞、CD8 + T 中央记忆细胞和经典单核细胞在康复个体中表现出增强的细胞因子和趋化因子受体表达。
5、总结说明
通过可视化图形展示了健康组、感染组和康复组中不同细胞类型中 WTA 和 AbSeq 之间的差异。
基因表达图表示 WTA 和 AbSeq 组中具有不同表达（圆圈大小）的各种基因（圆圈颜色）。
很多文献说明，mRNA 水平只能解释蛋白质水平 40% 的差异，而 60% 则无法解释。观察到的 RNA 和蛋白质水平差异可以追溯到具有众多复杂动态成分的复杂相互作。包括加帽、RNA 编辑和可变剪接在内的转录后调控在塑造蛋白质表达方面起着必不可少的作用，并导致 mRNA 和蛋白质水平之间的差异。所以，通过多组学方法（WTA+Ab Seq）找到更准确、更细致的差异化、异质性数据还是非常具有必要性的。
AbSeq 是一种非常有效的Cell surface Marker研究方法，具有多指标、定量结果、高灵敏度和标志物选择的灵活性。AbSeq 对于基于单细胞的研究，比如cell marker注释和识别细胞簇方面起着至关重要的作用。
