凝胶过滤层析实验优化小技巧

想要达到尽可能高的分辨率，选择合适的产品非常重要。凝胶过滤层析的选择可以按照三步策略：选择合适的分离范围，使用合适的上样量，以及尽可能选择粒径较小的层析柱。

（1）选择合适的分离范围

在购买层析柱或者选择实验室已有的层析柱时，首先应关注层析柱适合的分离范围。例如下图所示，不同的层析柱适合的蛋白分离范围也有差别，表明层析柱在这个分子量范围内具有最佳的分离效果。目标蛋白的分子量应在层析柱的分离范围内，如果多个层析柱分离范围有重叠，则目标蛋白的分子量在分离范围靠近中间较好。

（2）使用的合适的上样量

凝胶过滤层析对上样量有限制，根据实验目的的不同，Cytiva也为客户提供多种不同规格的层析柱。普通的10/300的柱型，柱体积是24ml，上样量最大为500ul；3.2/300和5/150柱型则适合于更小的上样量；如果上样量较大，也可以选择120ml和320ml的Hiload柱型，最大可上样13ml。

（3）尽可能选择粒径较小的层析柱

在购买和选择层析柱时，每个层析柱都会标明里面填充的凝胶小球的粒径。粒径较大的凝胶小球流速快，反压小，但通常分辨率不高。如果想要达到较高的纯度，应尽可能选择粒径较小的层析柱。如下图，Superdex Increase系列粒径为9um，是高分辨率的优选。

凝胶过滤层析在分离时需要有较长的路径，因此柱高越长，分离效果会越好。一般柱高增加一倍，分辨率可以提高约40%。因此，如果是出于分离目标蛋白和杂蛋白的目的，应选择较长的10/300的柱子，5/150的柱子更适合于做快速筛选。

如果选择空柱自己填装，也应在确定柱体积的情况下，尽可能选择直径较小，柱高较长的“细长型”的柱子，可以达到更高的分辨率。

如果实验室没有较长的层析柱，也可以选择将两个层析柱串联使用，以提高纯度。

层析柱中填料的装填效果对分辨率也会产生较大的影响。Cytiva的预装柱在出厂前已经进行了柱效测定，具有严格的出厂柱效标准。如果是自己填装的层析柱，通过直接观察很难观察出填料装填的好坏，因此需要进行柱效测定。填料排列不整齐，或者填料大小不均一，或者填料有破碎，都会极大的损害到分离效果。柱效检测的方法可以参考操作视频。如果柱效不佳，可以考虑重新填装柱子，并且在购买填料时，应尽可能选择粒径均一，没有破碎的优质填料。

层析柱经过一段时间的使用，如果发生堵塞，超压等不良使用的情况，也可能造成柱效降低，此时也可以通过柱效检测的方法重新进行柱效检测。