开发和制造侧流免疫试纸条常用的材料与工艺，一文讲透试纸条各组分（膜、结合垫、样品垫、吸水垫、底板材料、标记物）关键节点，值得收藏

本文主要介绍侧流免疫试纸条中的常见组分及各个组分所用的标准材料，同时还讨论了这些组分的加工方法，以及对于典型的侧流分析，材料是如何驱动制造和研发过程发展的。

下图概述了传统侧流免疫试纸条大体的生产流程。事实上，自LFIA开发至今，每个制造步骤所用的材料和工艺以及这些材料的应用方式，基本上没有大的改变。

典型侧流免疫层析制造工艺的概述

一、试纸条组分

1、膜/分析区域

功能:分析区域的作用是把蛋白质固定到测试区和质控区，并维持其在保质期内的稳定性和活性。测试时，来自结合垫的结合物和样品迁移至反应区，并在测试线和质控线上发生反应，最后过量的液体、结合物和反应物不被结合流出分析区域。

材料:一直以来，绝大多数侧流免疫试纸条的材料都采用硝酸纤维膜。人们也尝试过使用例如尼龙膜和聚偏氟乙烯(PVDF)膜等其他材料，然而并未取得很大的成功，主要的原因在于成本高、不实用，同时相关从业人员需要接受新化学处理手段和加工工艺方面的培训，以及硝酸纤维膜的使用已相当成熟，使得更换材料存在较大的阻力。

硝酸纤维素膜虽然是十分重要的功能材料，但不是LFIA 中分析膜的理想基底。但它确实具备一些特性，使其具有很强的实用性，并且依然是目前唯一一种成功广泛应用准卒试纸条的膜材料。这些特性包括相对较低的成本、良好的毛细管流动性、高蛋白结合能力、相对容易处理(直接成型或背衬膜)，以及各种商用产品具有不同的芯吸速率和表面活性剂含量等。然而在实际应用中，硝酸纤维素膜也暴露了许多缺陷。这些缺陷包括批内和批间膜性能的重现性不好、保质期问题、易燃(主要在无背衬膜中)、会受到环境因素影响例如相对湿度以及其可变特性会在加工期间造成破损(如果没有背衬)、挤压和擦划。为了改善这些问题，开发商和制造商投入了大量的时间和精力去优化膜的化学组成，去克服材料本身固有的问题。同时开创新的生产工艺，确保产品在保质期内可保持良好性能。严格控制喷点、浸渍、干燥等关键工艺，并注意膜的化学/生物处理，防止在成品中引入预期之外的变化，这是成功的关键。

流动特性:作为测流免疫分析系统中的反应基底，材料必须亲水且具有一致的流动特性。作为基础材料的硝酸纤维素是疏水的，可通过在膜生产过程中加入再湿润剂使其变得亲水。再湿润剂为表面活性剂，其种类、用量和添加方法，不同的制造商或同一制造商生产的不同品牌都不相同，这些因素自始至终都会影响检测的性能。因蛋白质与表面活性剂并不总是兼容的，因此，研发阶段需对多种膜进行选。由于膜在储存过程中会逐渐脱水，所以其流动性能也会发生变化。可以把硝酸纤维素膜设想为海绵，其中的膜孔被水撑开，如果把水除去，膜孔就会崩塌，从而降低了膜的毛细管吸附能力，导致流速发生改变。由于流速直接影响检测的灵敏度，反应时间延长可能会产生假阳性结果，这是导致误差的一个主要原因。侧流免疫试纸条能正常发挥其作用的关键在于:它仅在所需部位，即测试线和质控线处结合反应物。膜的蛋白结合能力、与蛋白质的相互作用及其动力学过程等一系列参数决定了选用哪种蛋白质比较合适，而且还影响检测的灵敏度。蛋白质通过静电、氢键和疏水作用结合到硝酸纤维素膜上。保证检测灵敏度和重现性的关键要素之一是免疫活性蛋白需均匀固定在测试线和质控线上。众所周知，大多数蛋白质不能共价或定向结合到硝酸纤维素膜上，所以被动结合到膜表面后会损失大部分免疫活性。目前普遍采取的结合方式是让蛋白质先通过静电作用吸附到膜上，然后通过疏水键和氢键达到长期结合的效果。很多因素都会影响蛋白质与膜的结合过程，以下是在开发试纸条和处理硝酸纤维素膜时必须考虑的一些因素:

a.试剂选择

非特异性蛋白:膨胀蛋白[如牛血清白蛋白(BSA)，酪蛋白等]竞争结合位点

干扰氢键的试剂:甲酰胺和尿素

干扰疏水相互作用的试剂:Tween和Triton

干扰蛋白质结合的聚合物:聚乙酸乙烯酯(PVA)、聚乙吡咯烷酮(PVP)和聚乙二醇(PEG)等

b.环境

湿度条件需要经过优化以更有利于结合(室温下相对湿度为25%~50%)

c.处理方法

喷点方法:接触与非接触式喷点对蛋白在膜上结合或扩散会有影响

干燥方法:高温鼓风干燥箱干燥还是常温干燥。千燥时间和方法均会影响膜上蛋白的重排和活性

稳定性:在整个保质期中,测试线和质控线上所结合的蛋白的稳定性和膜的流动性能均不能发生改变。

膜处理:硝酸纤维素膜组装至成品前，必须经过多道工序，包括先用定量喷点机将蛋白固定在测试线和质控线处，然后用鼓风干燥箱高温干燥，最后浸渍使其封闭。为了使蛋白质固定到膜的测试线和质控线上,使用接触式或非接触式喷点系统将蛋白以条状喷至膜上，随后进行封闭以控制并稳定其流速和水合特性，避免非特异性结合。两条线的喷点方法应尽可能做到精准定量,且不应随材料的水合或吸收特性而变化。非接触式喷点法是将蛋白质定量喷洒到硝酸纤维膜上的最佳方法。封闭是为了防止蛋白质和结合物结合到测试线和质控线以外的区域。此外，封闭还具有其他作用，包括维持膜的水合作用、改善毛细管扩散速率，以及维持测试线和质控线上蛋白的稳定性。封闭通常是将膜浸没在含有蛋白质、表面活性剂和聚合物的溶液中，该过程相对来说难以控制。为了保证终产品在整个保质期内都具有最佳性能，必须小心控制封闭过程。随后吸除膜表面多余的液体并利用鼓风干燥箱进行干燥。同样的，干燥过程也需优化，以减少成品间的差异。

适用性和膜的选择:膜类型和特异性蛋白的正确组合是功能测试能够成功的一个重要因素。不同的硝酸纤维素膜结合不同的蛋白质时，其性能会有巨大差异，因此,各种供应商和品牌的硝酸纤维素膜都需要考虑。膜的性能通常由所用聚合物类型、孔径、表面活性剂类型、用量和使用方法等因素限定。用于侧流免疫分析的膜的孔径范围一般为8~15 mm，对于硝酸纤维素膜来说，孔径是一个不太准确的表述，因为聚合物的结构并不是管孔状，而是用于流体和颗粒移动的曲折海绵状通道。“芯吸速率”或”毛细上升时间”比膜孔径更适合衡量膜的流动特性。毛细上升时间是生产商制定的一种规格，指的是液体前沿流经40mm长度的膜所需的时间。选择合适的芯吸速率会影响试纸条的动力学参数和检测速度，对分析方法的性能和灵敏度具有关键作用。

2、结合垫

目的与基本特征:侧流免疫试纸条中结合垫的作用是装载结合物颗粒，使其在整个保质期内保持稳定,并在测试时能有效和可重复地释放结合物。实际操作时，结合物的固定、干燥以及释放都会影响试纸条性能的变异系数(CV)。结合物混合不均匀或释放不良均会对试纸条的灵敏度造成不利影响。根据反应体系的不同，有些需要快速释放结合物，而有些更适合缓慢释放。但不管是快还是慢，结合物的释放都必须是持续稳定的。基于所用材料的特性，通常需要预处理结合垫以确保结合物的稳定性和最佳释放条件。结合垫预处理的方法是将其浸入含有蛋白质、表面活性剂和聚合物的水溶液中，随即干燥。这个过程类似前面描述的膜浸渍和干燥，既可通过手工批量处理也可采用连续的流水线处理，而后者生产的产品均一性更好。

将结合物装载到经过预处理的结合垫上是决定试纸条最终性能的关键步骤，通常有两种方法。第一种是将已处理过的结合垫浸入结合物颗粒的悬浮液中。第二种是采用非准接触式喷点机如微定量喷头BioDotAirJetQuanti 3000进行定量喷酒。对于结合物体系，选择合适的标记物和恰当的固定方法非常重要。常用的标记物包括胶体金及彩色或荧光单分散性乳胶颗粒标记物可以共价或被动偶联，也可以定量读取。共价偶联对试纸条的定量检测至关重要，因为与被动偶联不同，其配体和颗粒物之间形成的键更稳定。

材料:材料一般选择玻璃纤维，聚酯纤维，或人造丝。

流动特性:为达到最佳效果，材料必须亲水，并且保证液体快速流动。侧流免疫分析试纸条使用的大部分材料本质上是疏水的，所以必须进行预处理，使其具有亲水性。预处理通常由试纸条生产商完成，而不是材料供应商，但也有例外情况。最具欤瘡盎干名的兿騉儂买 Whatman 公司(Kent，UK)生产的Accufow系列预处理结合垫，预处理的方法是将垫浸入含蛋白质、聚合物和表面活性剂的溶液中，然后如上所述在高温下干燥。

释放特性:在货架期内，结合垫必须高效、可重复地释放结合颗粒。通常，由于结合颗粒物与材料纤维的结合特性，会导致释放发生变化。在进行优化时，研发化学稳定性好的材料应最大限度地减少这种变化，使结合颗粒最有效释放显得尤为重要。

稳定性:在整个保质期内(长达两年)，结合垫上的结合颗粒必须保持稳定，而大部分材廒埋插中的黏合剂往往会影响其稳定性。因此，优化试纸条时，要考虑不同材料与蛋白-结合物颗粒的相容性问题。

制造商和制备问题:最常见的产品来自Whatman(Kent，UK)、Ahlstrom(Helsinki, Finland)、Pall Gelman (East Hills, NY,USA)和 Millipore (Bedford,MA)这几家公司。在侧流免疫测定中，结合垫变化最容易引起实验误差。材料的变化可导致下列情况:预处理液体和标记结合物不相容、结合物不稳定、结合物释放不良，以及结合物与疏水性纤维的结合。为了使这些影响最小化，优化结合物颗粒时必须特别注意垫的预处理和颗粒的固定。

3、样品垫

目的：侧流免疫试纸条的一个主要优点就是只需一步便可实现各种样品的检测。样品的种类多种多样，如产妇的全血、结核病患者的痰或散装碎牛肉。样品垫起着承载样品并使其与试纸条其余组分相容的重要作用，并高效释放待测物。样品的处理包括滤出微粒或血细胞、调节样品PH、主动结合可能干扰检测的样品组分，以及破坏基质组分如黏蛋白等，从而释放待测物。由于许多现成的材料不均匀并含有不同的黏合剂，因此，如何选择满足上述功能的材料对检测性能具有很大的影响。样品垫的预处理方法和结合垫一样，通常就是浸渍和干燥。如有必要，预处理方案需谨慎选择，以免引入变化源，包括缓冲液浓度梯度和干燥过程的边缘效应等。

材料:样品垫所用的材料取决于应用的需求。这种材料通常是纤维素、玻璃纤维、人造丝和其他过滤介质。

容量:样品垫材料必须用缓冲液和其他成分进行预处理，干燥后再使用。它还必须能以受控的方式容纳滴加到其上的所有样品体积，从而有助于将流体引导到测定材中，而不会溢出或在表面流动。

强度:样品垫材料应足够坚固，以便在制造过程中处理。重点需要考虑的一点是遇湿抗拉强度。大批量生产时，垫材浸入流体罐中，它必须能承受来自卷轴到卷轴生产系统的张力，而不至断裂。浸渍作为预处理的其中一步，可用含有pH缓冲液、表面活性剂、封闭试剂(如果需要)、添加剂和其他可以提高检测灵敏度的试剂浸泡样品垫。某些情况下，样品垫和结合垫采用同一体系，但这种情况并不常见。一般情况下，标记结合物和测定缓冲液是不相容的。在一些检测中样品垫和结合垫采用同一种材料，但分开处理再组装到一起的情况也时有发生，只是不常见。

4、 吸水垫

目的:吸水垫是试纸条的驱动部件，目的是推动样液在试纸条上持续流动。应注意避免液体回流，否则会出现假阳性结果。

材料:通常选用高密度纤维素。一般依据吸收能力、成本和厚度来选择吸水垫的材料，同时也要考虑材料在辊槽中的抗拉强度和可用性。吸水垫的材料可选择的品牌很多，比较常见的是Millipore、Whatman、Ahlstrom和Pall Gelman。

5、底板材料

目的:为得到具有一定硬度和易手持的试纸条，侧流中所有部件是叠压到底板上的。底板上涂覆有压敏黏合剂，从而确保各部件安置就位。

材料:底板材料通常采用聚苯乙烯或其他涂有中等至高等黏性黏合剂的塑料。

注意事项:为了将不同功能区域的各种材料组装成为一个试纸条，必须安装底板。在传统的基于非读数仪的侧流免疫学中，层压过程允许在盒中的组成重叠和最终线放置中存在相对较大的内置偏差。重叠中的偏差会影响最终跑板效果，但在许多要求不高的应用中，该偏差是可以接受的。然而，跑板时间和流体前沿构象的变化对于测定的性能可能是致命的，这在基于读数仪的系统中尤其如此。其中，试纸条整个宽度上形成条带的均匀性、跑样速度、组装盒中条带的位置对于成功检测都是绝对的关键因素。这要求加工过程中的压层、切割和装壳都高度精准。自动化是这些工艺成功的关键。使用在线层压设备与照相系统、材料边缘传感器、切刀和装配传感器等，都是可行的方法。同时也要考虑黏合剂流入试纸条的其他组分，特别是无背衬膜、结合垫和样品垫，这可能导致流动模式的破坏、疏水斑块的产生，以及蛋白质的不稳定。因此，通常选用中等黏性而不是高黏性的合剂。为了保证试纸条的储存期，必须谨慎选择与蛋白质具有相容记录的黏合剂。

供应商:市场上多数采用G&L底板和 GL187 压敏黏合剂。

6、用于检测的标记物

在侧流免疫系统中最常用的颗粒检测试剂是胶体金和单分散的乳胶体系。目前连接有彩色染料、荧光染料、磁性或顺磁性粒子的乳胶颗粒已经商业化。在特定的侧流免疫系统中颗粒标记物和检测试剂的选择由多种因素决定。

(1)是否要求蛋白质共价结合到颗粒上?

如果有这个要求，那么只能使用活化的乳胶颗粒，因为蛋白质一般是通过被动吸附与胶体金结合。

(2)是定量检测还是定性检测?是否需要读数仪?

要实现真正的定量检测，需要在基础材料和技术上做更大的努力。如果检测需要用到读数仪，那么标记物的选择可扩大到包括胶体金、有色或荧光胶乳及顺磁性颗粒等。但是选择哪种标记颗粒和读数仪还需要考虑的因素有读数仪技术的成本、读数仪授权成本和可用性及标记技术、检测开发和读数仪集成的成本，以及读数仪与标记技术结合的性能等问题。

(3)检测的灵敏度需要达到什么水平?

依靠肉眼判断结果的试纸条通常使用胶体金而不是有色胶乳颗粒作为标记物，这是因为胶体金颗粒尺寸较小，可获得更高的灵敏度，在测试线处能形成填充密度更高的固定物。一般胶体金的粒径为20~40nm，而彩色胶乳颗粒为100~300μm。而且胶体金的颜色更鲜亮，检测时更容易识别弱阳性。此外，胶乳可以制备成多种颜色，并且可以利用较深的颜色，如深蓝色染料，与试纸条膜的白色背景形成巨大反差。在基于读数仪的检测中，一般选择使用荧光染料或顺磁性颗粒，以产生更高的灵敏度。

(4)是否为多元检测?

是否需要识别具有不同颜色的复合条带?如果是以上这些情况，那么只能选择彩色乳胶颗粒。因为彩色乳胶颗粒可以产生多种颜色的条带。

(5)需要考虑的制造成本有哪些?

ic ConsultingNetwork(DCN，Carlsbad，CA)。

一般来说，直接购买胶体金比自己制备更加经济实惠。但是,将胶体金的生产整合到侧流免疫试纸条的生产之中也是可行的，并且有不少公司这样做。然而，由于更加看重产品的质量与稳定性，并且希望尽可能地减少误差来源，不少企业还是选择与高品质的原料供应商合作。供应单分散乳胶的企业也很多，如BangsLaboratories和Merck/Estapor,它们生产的产品大多是高品质的。这种由于试纸条厂商不自主生产单分散乳胶而外包给其他企业所带来的成本也要加以考虑。

二、关于加工方法

传统和改进的制造工艺的比较是非常复杂的内容，这里只给出一个大纲。基本步骤包括喷酒试剂、将材料浸渍到大量试剂溶液中、干燥组分、层压材料、切条及包装。加工方法大致分两种。批量处理时，单独处理材料的卡长度，将其组装成卡，然后再切条:而在流水线或滚轴上生产时，所有部件都放置在传送辊上，直到一步步加工、叠层后，才进行切割装盒。行业数据表明，流水线生产能显著减少侧流免疫试纸条之间的差异。

在最后的分析中，侧流免疫技术的临床使用者们最担心的问题就是试纸条间可重复性差(Stratcom，未公布的市场调研)。故而减少产品间差异、开发及数据采集和分析报告等多功能联用性能为一体的系统是该技术能被更加广泛应用的关键。