DNA提取的11种方法。您都了解吗？
原创 乡间小路 生物试剂从业者必读 2025年09月04日 10:18 河北
DNA提取的方法有很多，经典方法有煮沸裂解法、酚-氯仿提取法等新方法有硅膜吸附法、磁珠分离法等。
一、煮沸裂解法
一般用于DNA的手工提取，分为一步法和两步法，一步法得到的DNA含有较多小分子抑制物。两步法是第一步在样本中加入沉淀剂后离心弃上清，以去除小分子抑制物并沉淀病毒颗粒;第二步加入裂解液后煮沸，以释放DNA及沉淀残留蛋白质等大分子抑制物，离心取上清即为得到的 DNA。
经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境，还能抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏、维持核酸结构的稳定等。去污剂则是通过使蛋白质变性、破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。
细胞的裂解方法很多，其中机械方法包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎但机械力也可引起核酸链的断裂，因而不适用于高分子量长链核酸的分离有报道称超声裂解法提取的核酸片段长度从小于500bp至大于20kb，而颗粒匀浆法提取的核酸一般<10kb。化学试剂法是在一定的pH值环境和变性条件下，细胞破裂、蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相。上述变性条件可通过加热、加人表面活性剂(SDS、TritonX-100、Tween20、NP-40CTAB、sar-cosyl、Chelex-100等)或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍)而获得。而pH值环境则由加入的强碱(NaOH)或缓冲液(TESTE等)提供。在一定的pH值环境下，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀，缓冲液中的一些金属离子整合剂(EDTA等)可螯合对核酸酶活性所必需的金属离子Mg2+、Ca2+，从而抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解。
其中含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组DNA的首选。高浓度蛋白质变性剂(如GIT、GuHCI等)的裂解方法，是抽提RNA的首选。含CTAB的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组DNA抽提的首选裂解方法。SDS碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。裂解液的用量原则为确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率;浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。
裂解过程也可有酶作用，主要是通过加人溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K植物蛋白酶或链酶蛋白酶)以使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进其与核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖 N乙酰葡糖胺和 N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1,4)键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键，其在65℃及有EDTA、尿素(1~4mol/L)和去污剂(0.5%SDS或1%TritonX-100)存在时仍保留酶活性，这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。
在实际工作中，酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。
二、酚:氯仿提取法
酚:氯仿抽提可算得上是核酸分离纯化技术中最经典的方法之一，该方法是由冷泉港实验室研究人员首先提出的，并被大量的科研究工作者进行改良使用。其原理是:在酚:氯仿的共同作用下，使蛋白质变性，形成不溶解的物质。由于蛋白质的密度小于酚而大于水，所以离心后，会在酚相和水相于之间，形成蛋白质中间层，而DNA位于上层水相中。用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来，也可用0.15mol/LNaCl液反复洗涤细胞破碎液除去RNP，再以1mol/LNaCl提取脱氧核糖蛋白，再按仿异醇法除去蛋白。两种方法比较，后者使核酸降解可能少一些。以稀盐酸溶液提取DNA时，加入适量去污剂，如SDS可助于蛋白质与DNA的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用，在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的络合剂，通常用0.15mol/LNaCl、0.015mol/L柠檬钠，并称SSC溶液，提取 DNA。
三、阴离子去污剂法
SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，阴离子去污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污剂提取 DNA。
四、苯酚抽提法
苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分黏稠的物质，可用玻璃慢慢绕成一团取出。此法的特点是使提取的 DNA保持天然状态。
本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改进，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH值为8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要行透析或沉淀处理，获得所需的DNA样品。
其中，EDTA为二价金属离子螯合剂，可以抑制DNA酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性;SDS为生物阴离子去垢剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质，与这些脂质和蛋白质的结合可以使它们沉淀，其非极性端与膜磷脂结合，极性端使蛋白质变性、解聚，所以SDS同时还有降解DNA酶的作用;无DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化;蛋白酶K则有水解蛋白质的作用，可以消化DNA酶、DNA上的蛋白质，也有裂解细胞的作用;酚可以使蛋白质变性沉淀，也抑制DNA酶的活性;pH值为8.0的Tris溶液能保证抽提后DNA进人水相，而避免滞留于蛋白质层。
多次抽提可提高DNA的纯度。一般在第三次抽提后，移出含DNA的水相，做透析或沉淀处理。透析处理能减少对DNA的剪切效应，因此可以得到200kb的高分子量DNA。沉淀处理常以醋酸铵为盐类，用2倍体积的无水乙醇沉淀，并用70%的乙醇洗涤，最后得到的DNA大小在100~150kb。
运用该法可以从单层或悬浮培养细胞、新鲜组织及血液标本中制备少于10ug至大到数百rg的DNA样品。由于分离纯化的每一步都有剪切力的影响，最后得到的DNA样品中分子量超过100~150kb的很少，但这种大小的 DNA足以作为PCR反应的模板和进行Southernblotting分析以及构建以入噬菌体为载体的基因组DNA文库。从5X10’个培养的非整倍体哺乳动物细胞(如HeLa细胞)中，大约可以制备分子量在100~150kb的DNA200μg，自20ml血液中可得DNA 250μg。
五、水抽提法
利用核酸溶解于水的性质，将组织细胞破碎后，用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中，离心后收集上清液。在上清中加入固体氯化钠调节至2.6mol/L，加入2倍体积95%乙醇，立即用搅拌法搅出。然后分别用66%、80%和95%乙醇以及丙酮洗涤，最后在空气中干燥，即得DNA样品。此法提取的DNA中蛋白质含量较高，故一般不用。为除蛋白可将此法加以改良，在提取过程中加入SDS。
六、甲酰胺解聚法
为构建高容量载体的DNA文库和进行分子量巨大的DNA片段的脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)分析，需要制备分子量大于200kb的DNA。该法细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物(即染色质)，然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。甲酰胺是一种离子化溶剂，既可以裂解蛋白质与DNA的复合物，还可使释放的蛋白质变性。但甲酰胺对蛋白酶K的活性无显著影响。本法因操作步骤少，尤其省却了酚的多次提取，所得DNA分子量一般可以大于200kb。
七、玻棒缠绕法
缠绕法适于同时从不同的细胞或组织标本中提取DNA。与前两个方案不同，它有两个关键步骤:一是基因组DNA沉淀于细胞裂解液与乙醇的交界面;二是要将沉淀的DNA缠绕于带钩玻棒上。通过带钩玻棒将高分子量DNA沉淀从乙醇溶液中转移到pH值8.0的TE溶液重溶。小DNA片段与RNA不能有效形成凝胶状线卷。该方案以盐酸胍裂解细胞，制备的DNA分子量只有大约80kb，不能有效构建基因组DNA文库，但用于Southern杂交和 PCR 反应可以获得很好的结果。
八、反复冻融法
将细胞在-20℃以下冰冻，室温溶解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。至少3次以上冻融。
九、硅膜吸附法
根据硅胶模特异性吸附原理以实现核酸分离，首先使用裂解液、助沉剂和无水乙醇实现核酸和蛋白质的分离和浓缩;用核酸吸附柱将核酸吸附于硅胶膜;使用洗涤液去除残留在膜上的蛋白质杂质和有机物;最后使用洗脱液将纯化的核酸(DNA/RNA)从膜上洗脱。
十、磁珠分离法
磁珠法提取 DNA试剂盒是纳米技术、分子生物学技术、生物医学技术和法医学技术的综合高科技产品。可广泛应用于分子生物学、医学、法医学、考古学、大中小学的生物实验等许多领域。磁珠法提取DNA试剂盒与传统的方法相比，如Chelex100法、有机法、二氧化硅法、盐法等，具有更为简单、方便，转移离心管的次数较少，不易污染等优势。磁珠法在DNA纯化、微量检材及PCR扩增等方面是其他方法不可代替的。磁珠法提取DNA试剂盒有独特的裂解液:蛋白酶K能迅速裂解细胞并灭活细胞内核酸酶，使基因组DNA选择性吸附于磁珠，再通过一系列快速的漂洗-分离步骤，通过抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白质等杂质去除，最后用双蒸水即可将纯净基因组DNA从磁珠上洗脱。该方法适用范围很广，包括新鲜植物、动物组织，高温干燥过DNA、破坏比较严重的植物、动物组织，海洋生物，法医鉴定，新鲜哺乳动物血液或干血点，转基因食品等。
十一、核酸提取仪
核酸提取仪是应用配套的核酸提取试剂来自动完成样本核酸的提取工作的仪器，核酸提取仪分为两类:一类是大型自动化核酸提取仪，一般称为自动液体工作站;另一类是小型自动核酸提取仪，利用封装好的配套试剂自动完成提取纯化过程。大型自动液体工作站因为设备成本高昂，运行成本高适合一次提取几千个同一种类标本，所以真正得到应用的比较少;而小型自动化的仪器，因为仪器设备和运行成本低、操作方便得到越来越多的应用。现在有很多国家科研机构研制的快速核酸提取仪，在核酸的研究中应用很广。快速核酸提取仪是一种特殊、快速、高效率、多试管的一致系统。它与配套的试剂盒一起使用，就能将任何来源(包括土壤、植物和动物的组织、器官、细菌、酵母、真菌、孢子、古生物标本等)的原始DNA、RNA和蛋白质进行提取和纯化。该系统避免了研磨、匀浆、超声波处理等传统方法的费力、耗时、低效等诸多缺点，可以高效、快速、稳定地裂解并纯化各种类型样品的蛋白和核酸，可用于分离纯化各种类型样品的核酸和蛋白，包括土壤、植物和动物的组织、器官、细菌、酵母、真菌、孢子等各种标本。
