生工技术 | 酵母载体简介

酵母是真核生物，因此含有与动植物相似的复杂内部细胞结构。与细菌不同，酵母可以翻译后修饰蛋白质，但它们仍具有与原核生物一起使用的许多相同的技术优势。与大多数其他微生物不同，酵母具有稳定的单倍体和二倍体状态，可用于遗传分析，并且具有同源重组的有效机制，可促进简单的基因替换/突变。实验室中使用的酵母表达质粒通常包含所有必需的成分，以允许在大肠杆菌和酵母细胞之间穿梭 。

酿酒酵母中的质粒可以分为以下两种：

酿酒酵母野生型质粒：

2u质粒(2u plasmid)

酿酒酵母人工构建质粒：

○酵母整合质粒（Yeast Integrating plasmids，YIp）

○酵母复制质粒（Yeast Replicating plasmids，YRp）

○酵母着丝粒质粒（Yeast Centromere plasmids，YCp）

○酵母附加质粒（Yeast Episomal plasmids ，YEp）

 

 

2u质粒是酿酒酵母中常见的质粒，结构示意图如下：

2u质粒大小约为6kb，为环状质粒，拷贝数可以达到50~100个，在质粒上有上图中有REP，FLP，IR以及ori

REP在质粒上有REP1，REP2和REP3可以其产物可以控制质粒的稳定性。

FLP编码的产物可以驱动IRs，发生重组

Ori:为复制起始位点

IRs 为反向重复序列，长度约600bp，可以进行重组，因为发生了重组可以变成如下图的情况，会有两种质粒的形式。

人工构建的质粒可以分为以下四种：酵母整合质粒（YIp）、酵母复制质粒（YRp）、酵母着丝粒质粒（YCp）、以及酵母附加质粒（YEp）。

● 非自主复制型质粒

酵母整合质粒（YIp）

顾名思义，此类质粒缺少复制起始区，质粒需要通过同源重组整合到酵母的基因组上才能进行表达。标准的酿酒酵母整合型质粒一般携带MCS、选择性标记、整合特异性靶序列。

● 自主复制型质粒

自主复制型载体的构建主要包括引入复制子结构、选择标记基因、克隆位点（MSC）三部分组成。

○ 酵母复制质粒（YRp）

含有复制起始区，复制子为克隆宿主染色体上的ARS。能在酵母染色体外自主复制的一种载体，拷贝数较高，但在细胞分裂时很难在母细胞和子细胞之间平均分配，会导致子代细胞拷贝数减少。

○ 酵母着丝粒质粒（YCp）

此类质粒含有酵母染色体着丝粒的DNA片段，将基因组着丝粒元件（CEN）序列插入酿酒酵母ARS型质粒中，能使质粒在细胞分裂时能在母细胞和子细胞之间均匀分配，稳定性比YRp和YEp高，但是拷贝数比较低（1~5个）。

○ 酵母附加质粒（YEp）

Yep是含有酿酒酵母2u质粒复制相关的序列，含有2u质粒所属的复制子。该载体在酵母细胞中稳定。

在以上述几种质粒作为基本骨架，再添加其他元件便构成一系列用途广泛的酿酒酵母表达载体，一些质粒载体在如下表中。

注：英文缩写及其含义

酿酒酵母基因组自主复制元件 ARS

酿酒酵母基因组着丝粒元件   CEN

酵母转座子Ty转座子或δ重复序列

URA3 尿嘧啶合成，酿酒酵母

LEU2  亮氨酸合成，酿酒酵母

TRP1  色氨酸合成，酿酒酵母

毕赤酵母没有天然的质粒，主要的载体分为分泌型载体和非分泌型载体。一些常用的毕赤酵母表达载体在如下表中。

BroachJ R , Li Y Y , Feldman J , et al. Localization and sequence analysis of yeastorigins of DNA replication.[J]. Cold Spring Harbor Symposia on QuantitativeBiology, 1983, 47 Pt 2(5):1165