神经元与神经胶质细胞培养攻略
神经元和神经胶质细胞是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元负责接收、处理、传递和储存信息。神经胶质细胞为神经元提供结构支撑并参与免疫反应，如星形胶质细胞可维持血脑屏障、参与损伤修复；小胶质细胞可除病原体、参与炎症反应；少突胶质细胞可形成髓鞘包裹轴突，加速神经信号传导；对于神经元及神经胶质细胞的研究有助于探究神经系统的发病机制及疾病治疗。
本期我们重点学习神经领域研究根基—神经细胞培养攻略，接下来小优会从神经细胞发育、原代细胞提取、神经细胞分选、神经细胞培养、神经细胞鉴定及神经相关热门研究六个方面带大家学习不同神经细胞研究的必备技能！
一
神经细胞发育
神经干细胞在血管和星形胶质细胞构成的微环境中，增殖产生神经祖细胞。神经祖细胞发育为神经母细胞，并开始迁移，随后逐渐分化为未成熟神经元，2-3周时形态和功能进一步发展。未成熟神经元继续发育，4周后成为成熟神经元，部分可与海马体CA3区建立连接，行使神经功能【1】。
二
原代细胞提取
原代神经元主要从胚胎期或新生动物的中枢神经系统（CNS）组织中提取，具体取材部位取决于研究神经元细胞类型，如：谷氨酸能兴奋性神经元可从大鼠/小鼠胚胎（E15-E18）大脑皮层中提取；CA1/CA3区锥体神经元可从大鼠/小鼠胚胎（E15-E18）海马体中提取。取材需要考虑组织发育阶段，如胚胎期（E15-E19）胶质细胞未大量增殖，因此神经元纯度＞90%，而新生期（P0-P7）需结合酶消化+差速贴壁法去除胶质细胞。神经元抗污染能力极弱，需在超净台+抗生素环境下操作，胰酶处理通常不超过15-20分钟（37℃），为避免细胞死亡需控制从取材到接种过程在2-3小时内完成。神经元细胞在接种前要做好基质包被，多使用多聚赖氨酸（PLL）、层粘连蛋白（Laminin）等。
星形胶质细胞一般选择新生大鼠/小鼠（P0-P4）的大脑皮层、海马或者脊髓，此时期神经元和少突胶质前体细胞较少，易于获得高纯度星胶；小胶质细胞一般选择新生至幼年大鼠/小鼠 (P0-P14)的大脑皮层、中脑或脑干，因出生后早期是小胶质细胞定居和增殖高峰期，成年大脑也可提取，但细胞得率、活性和纯度会下降；少突胶质细胞一般选择新生大鼠/小鼠 (P0-P3)的大脑皮层、胼胝体、脊髓，少突胶质前体细胞（OPCs）在出生前后大量存在于白质和灰质中。
原代神经细胞提取步骤（新生鼠脑为例）:
1.配制酶溶液：根据使用的酶解试剂盒说明书表格精确配制Enzyme Mix 1和Enzyme Mix 2；
2.取材与称重：取小鼠脑组织，在1 mL无钙镁HBSS（SH30588.01）中称重；
3.将最多400 mg的组织转移至提前加好说明书要求体积Enzyme Mix 1的gentleMACS C Tube（130-093-237）中；
4.向C Tube（130-093-237）中加入30μL的Enzyme Mix 2，轻柔颠倒混匀；
5.拧紧管盖，倒置安装在gentleMACS Octo组织处理器（130-096-427）上，确保样品位于转子/定子区域，运行预设程序37C_NTDK_1；
6.程序结束后，短暂离心收集管底样品；
7.将细胞悬液通过预湿的70μm MACS SmartStrainer筛网（130-098-462），并过滤到50 mL离心管中；
8.用10 mL含钙镁的HBSS（SH30030.02）清洗滤网和细胞；
9.弃去滤网，将细胞悬液在300×g下离心10分钟，并彻底吸弃上清；
10.用适当的缓冲液如PBS（SH30258.01）重悬细胞沉淀，用于后续实验。
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三
神经细胞分选
神经细胞分选的具体实验步骤请见本期次条：《成年鼠脑高活性神经细胞分选全攻略 | “小优带您做分选”线下邀约》
成年神经干细胞（Neural Stem Cells）是多能干细胞，具有自我更新和分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。神经干细胞在神经系统修复和再生中发挥着关键作用，并表达Nestin、Sox2、Pax6、GLAST和GFAP等特征性标志物。
神经元（Neurons）具有广泛的形态和生理异质性，缺乏特定表面标记物，只能通过标记非神经元细胞来间接分离与鉴定。
小胶质细胞（Microglias）是中枢神经系统的常驻免疫效应细胞。活化的小胶质细胞也可作为抗原呈递细胞。它们在形态学、免疫表型和功能上与单核/巨噬细胞谱系的细胞相关，常在人和小鼠中表达CD11b（大鼠中表达CD11b/c）、CD68、F4/80和MHC II类分子。
少突胶质细胞（Oligodendrocytes）在神经元轴突周围形成髓鞘，助于动作电位快速传导。少突胶质细胞前体细胞（OPCs）体外可通过Anti-A2B5抗体鉴定,体内通过PDGFR-α和AN2鉴定。当 OPCs 开始分化时表达POA，可被Anti-O4抗体识别。在少突胶质细胞发育过程中，O4表达始于A2B5阳性的晚期OPCs，随A2B5表达消失O4表达持续存在。随细胞分化可合成半乳糖脑苷脂、MBP、PLP、MOG和 O1。
星形胶质细胞（Astrocytes）中枢神经系统中数量最多的细胞类型，其形态和功能具有广泛的异质性，可调节离子和谷氨酸稳态、控制突触的数量和功能、促进伤口愈合、形成血脑屏障、并调节脑血流量。此外，星胶细胞在侧脑室侧壁SVZ和SGZ充当成年神经干细胞。GLAST是发育期和新生哺乳动物CNS星胶细胞标志物，ACSA-2抗原特异性表达于GLAST（ACSA-1）阳性星胶细胞，Anti-ACSA-2靶向抗原是ATP1B2；成熟星胶细胞也表达GFAP。
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【组织保存】
MACS® Freezing Solution，130-129-552
组织保存液，用于脑组织解离前的保存
【组织处理器】
gentleMACS 25 C Tubes，130-093-237
gentleMACS™ Octo Dissociator with Heaters，130-096-427
【组织解离试剂盒】
·适用所有神经细胞分离
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat，130-107-677
成年鼠（P＞7）脑组织解离试剂盒
Neural Tissue Dissociation Kit (P)，130-092-628
新生鼠（P≤7）脑组织解离试剂盒，木瓜蛋白酶
Neural Tissue Dissociation Kit (T)，130-093-231
新生鼠（P≤7）脑组织解离试剂盒，胰蛋白酶
·适用神经元分离
Neural Tissue Dissociation Kit—Postnatal Neurons，130-094-802
新生鼠（P≤7）脑组织解离试剂盒，同时适用于视网膜神经节细胞RGC的原代提取；
·适用特殊应用
Brain Tumor Dissociation Kit (P)，human , 130-095-942
脑部肿瘤组织的解离；
Neurosphere Dissociation Kit (P)，130-095-943
神经球解离试剂盒，适用于神经干细胞/神经球细胞的原代提取；
【质量优化&辅助试剂】
MACS SmartStrainer, 70 µM，130-098-462
细胞筛网，去除未解离的组织块和细胞团
Debris Removal Solution，130-109-398
碎片去除试剂，用于去除细胞碎片
Red Blood Cell Lysis Solution(10×)，130-094-183
红细胞去除试剂，用于去除裂红；
Dead Cell Removal Kit，130-090-101
死细胞去除试剂，用于去除死细胞，细胞膜损伤的细胞容易非特异吸附抗体；
Myelin Removal Beads II，130-096-433
髓鞘去除试剂，用于去除髓鞘，因脑组织解离后，髓鞘会以大量脂质碎片形式存在，不易降解，影响后续分析培养；
Hank‘s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, without Calcium, Magnesium, Phenol Red，SH30588.01
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, Phenol Red，SH30030.02
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X, 0.067M PO4, without Calcium, Magnesium, Phenol Red，SH30258.01
Papain Dissociation System，LK003150
木瓜蛋白酶系统，用于神经细胞解离的酶试剂
四
细胞培养
原代神经元培养需从特定脑区解剖组织开始，经酶解、吹打、过筛获得单细胞悬液。培养皿须经多聚赖氨酸（PLL）避光包被以促进神经元预神经突触的贴附与生长。细胞在37℃、5% CO₂条件下培养，需定期半量换液，并可用Ara-C抑制胶质细胞增殖。操作需轻柔避免机械损伤，且原代神经元为终末分化细胞，不可传代。
PLL/层粘连蛋白预包被细胞培养耗材步骤【2】
1.将10cm细胞培养皿置于摇床上，依次用丙酮清洗1次、无水乙醇清洗2次（摇床转速90 rpm/min），室温下摇15 min；
2.第2次用乙醇清洗后，将培养皿转移至层流柜中，然后用无菌双蒸水冲洗3次；
3.向10cm细胞培养皿中，加入7 mL 100μg/mLPLL（abs42155907-100ml）；
4.PLL包被后，用双蒸水冲洗两次并晾干，避免紫外线照射；
5.PLL包被的培养皿可保存在冰箱中，最长保存时间不超过一周。
原代神经元培养步骤【2】：
1. 将组织解离后的神经单细胞悬液离心，轻敲离心管底部，用预热至37℃的神经元培养基重悬细胞，使细胞团分离；
2. 使用血细胞计数板和0.2%台盼蓝溶液确定细胞数量；
3. 将神经元接种至PLL包被好的培养皿上，并加入500μL预热且平衡好的神经元铺板培养基（0.6% D-glucose（abs47014852-500g）、5% FBS（SV30208.02）、2mM L-glutamine（SH30034.01）、终体积至15mL的MEM培养基（SH30024.01））；
4. 接种密度：低密度建议2.5×10³cells/cm²，常规密度建议3×10⁴ cells/cm²；
4小时后使用预热且平衡好的维持培养基（0.5mM L-glutamine溶液（SH30034.01）、1mL B27（abs9120-10ml）、终体积50mL的神经专用培养基（abs9460-500ml））替换铺板培养基，24h后更换含Ara-C（abs44110389-25mg）的培养基抑制胶质细胞增殖；
5. 培养条件：37℃、5% CO₂、湿度95%；
6. 换液频率：每3-4天进行半量换液，不可传代；
7. 原代神经元可培养生长时间：7-14天；
8. 观察原代神经元镜下细胞学状态为成熟突触网络形成。
原代小胶质细胞培养成功关键在于组织来源、纯化方法和培养条件。根据年龄选择新生鼠脑（P0-P3），采用混合培养后震荡拍打法；或成体/胚胎鼠脑（需酶解后磁珠分选CD11b+细胞）。操作需轻柔避免机械损伤，并彻底去除脑膜以防成纤维细胞污染。培养需使用含M-CSF（10-50 ng/ml）的完全培养基以维持其存活与功能，并严格进行2-3天半量换液。注意原代小胶质细胞存活期短（7-14天）且不可传代，否则会迅速丧失其特性和功能。培养后应通过形态学（阿米巴样/分支状）及CD11b免疫标记鉴定纯度和活性。
原代小胶质细胞培养步骤【3】
1.预包被：培养瓶使用0.1 mg/mL 的PPL（abs42155907-100ml）预包被30分钟，冲洗晾干备用；
2.组织解离后的小胶质细胞单细胞悬液离心后，用完全培养基重悬细胞沉淀；
3.混合胶质细胞培养，将细胞悬液接种到预包被T-75培养瓶中，于37℃、5% CO₂培养。
4.5小时后，混合细胞已贴壁，并于第1天和第5天进行全量换液；
5.小胶质细胞分离（拍打法），第6天，小胶质细胞在星形胶质细胞层上形成疏松贴附层，此时即可收获。核心步骤：手持培养瓶，在实验台边缘轻拍三次，使小胶质细胞震落至培养基中。收集含有小胶质细胞的培养基，离心（800×g,5分钟）后重悬。
6.纯化与培养，将重悬的细胞接种到新的培养器皿中，24小时后细胞会充分贴壁伸展。培养使用含10% FBS（SV30208.02）的DMEM（SH30022.01）完全培养基。为维持细胞存活，可添加M-CSF（UA040056-1mg）。
7.注意：原代小胶质细胞存活期短（约7-14天），且不可传代，否则会丧失功能。
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五
神经细胞鉴定
神经细胞鉴定常用的方法为流式鉴定，常见的神经细胞表面marker见下表：
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细胞类型 |
关键表面标志物 |
备注 |
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神经干细胞 |
GLAST (ACSA-1) |
Nestin、Sox2、Pax6、GFAP多为胞内标志物，GLAST是重要的功能性表面转运蛋白和标志物 |
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神经元 |
无特异性表面标志物 |
缺乏特定表面标志物，需通过排除非神经元细胞（如CD45⁺的免疫细胞）来间接鉴定 |
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星形胶质细胞 |
GLAST (ACSA-1) ACSA-2 (ATP1B2) |
ACSA-2是表面标志物，GFAP是胞内标志物 |
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少突胶质细胞 |
A2B5 PDGFRα NG2 O4 |
标志物随细胞发育动态变化： |
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小胶质细胞 |
CD11b (人和小鼠) CD11b/c (大鼠) CD68，F4/80 MHC Class II(活化时) |
CD11b是小胶质细胞最核心的表面标志物，CD45（通常为低表达）常与CD11b联用以区分常驻小胶质细胞（CD11b⁺CD45ˡᵒʷ）和浸润巨噬细胞（CD11b⁺CD45ʰⁱᵍʰ） |
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六
神经研究热门应用
随着全球人口老龄化加速，神经退行性疾病的发病率逐年攀升，深入解析其复杂发病机制成为寻求有效治疗策略的迫切需求。目前，神经退行性疾病主要三大关键病理机制已被证实：1.蛋白质稳态失衡，如β-淀粉样蛋白、α-突触核蛋白等的异常聚集与错误折叠，成为阿尔茨海默病和帕金森的病理标志；2.线粒体功能障碍与氧化应激，线粒体能量的代谢紊乱导致活性氧过量累积，加速神经元凋亡；3.应激反应失调，应激反应持续激活可驱动神经元凋亡，如SIFI复合物失调。
尽管如此，神经退行性疾病研究仍然面临病因不明、诊断困难、治疗受限的三大挑战。病因层面，疾病机制复杂，早期体液中pg级的微量生物标志物，如p-tau181，难以被传统技术精准检测。诊断层面，早期症状与衰老相似，脑脊液等样本量少且标志物浓度极低，如Aβ42/40，要求检测技术兼具超高灵敏度和宽动态范围。治疗层面，传统药物仅能缓解症状，新型疗法受限于血脑屏障和疾病异质性，亟需能实时监测疗效的分子体系。
破解这些神经疾病研究困局依赖于技术突破，MSD超敏电化学发光技术不仅能满足全病程生物标志物发现和早期诊断需求，还能通过微量样本中biomarker的精准量化加速临床前研究与验证，推动基础研究向临床转化，在神经领域研究中，MSD能够检测的重要靶点如下：
MSD电化学发光技术平台优势：
1. 多因子检测技术；
2. 灵敏度达fg级别；
3. 样本量少＜25uL；
4. 线性范围5-6个log；
5. 样本类型丰富：脑脊液、房水等；
6. 开放性平台、方法学开发；
7. 人Bio-marker最大检测panel达131因子；
8. 设备搭配的试剂盒检测指标≥651个。
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Cat.No |
Panel |
Analyte |
Species |
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S-PLEX Neurology Panel 1 (human) Kit, SECTOR (1 PL) |
GFAP,Neurofilament L,Tau(total) |
Human |
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S-PLEX Neurology Panel 1 (NHP) Kit, SECTOR (1 PL) |
GFAP,Neurofilament L,Tau(total) |
NHP |
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V-PLEX Plus Neuroinflammation Panel 1 (hu) Kit, SECTOR (1PL) |
CRP, Eotaxin, Eotaxin-3, Flt-1/VEGFR-1, ICAM-1, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12/IL-23p40, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A, IP-10, MCP-1, MCP-4, MDC, MIP-1α, MIP-1β, PlGF, SAA, TARC, Tie-2,TNF-α, TNF-β, VCAM-1, VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D |
Human |
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V-PLEX Plus Ab Peptide Panel 1 (6E10) Kit (1 Plate) |
Aβ38 (6E10), Aβ40 (6E10), Aβ42 (6E10) |
Human |
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V-PLEX Plus Ab Peptide Panel 1 (4G8) Kit (1 Plate) |
Aβ38 (4G8), Aβ40 (4G8), Aβ42 (4G8) |
H M R |
如您的实验室暂无MSD检测设备，蛋白检测服务专家LabEx可提供MSD检测外包服务：
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参考文献：
