技术文章 | 体外转录中修饰核苷酸对mRNA疗法的影响及如何准确定量dsRNA
体外转录中的修饰核苷酸：
小改变，大影响
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在我们关于双链RNA（dsRNA）的最终篇文章中，我们将目光投向mRNA疗法的化学基石——修饰核苷酸。这些看似微小的RNA序列改变，对mRNA疫苗和疗法的成功起着关键作用，但也为精准检测和定量有害dsRNA副产物带来复杂性——这些步骤对确保mRNA产品的治疗效力至关重要。
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什么是修饰核苷酸？
修饰核苷酸是含有化学修饰核糖核苷的核苷酸——就像替换经典食谱中的特定配料来提升风味与营养。正如厨师可能使用无乳糖牛奶或无麸质面粉来保持菜品核心结构的同时更易消化，科学家在体外转录（IVT）过程中通过化学修饰核糖核苷来优化mRNA疗法的性能。这些修饰核苷酸会取代最终RNA产物中的天然核苷酸（如尿苷或胞苷），从多个方面提升mRNA疗法的效能与安全性：
降低免疫原性
通过掩盖合成的mRNA使其不被TLR3、TLR7、RIG-I和MDA5等模式识别受体发现，修饰核苷酸能减少先天免疫激活和炎症风险。
提升稳定性
这些修饰有助于RNA形成有利构象，并保护分子免于降解，从而延长其细胞内半衰期。
增强蛋白表达
降低的免疫识别与提升的RNA稳定性共同促进更高效的翻译过程，使相同剂量下产生更多蛋白质。
减少dsRNA形成
部分修饰核苷酸能抑制IVT过程中非预期dsRNA的生成，从而限制免疫触发并提高产品一致性。
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mRNA疗法中的关键修饰核糖核苷
以下化学修饰核糖核苷常用于IVT过程以制备功能性治疗mRNA：
假尿苷（Ψ）
尿苷的异构体，通过改变糖苷键增强免疫逃逸并降低干扰素反应。
N1-甲基假尿苷（m1Ψ）
Ψ的甲基化变体，广泛应用于mRNA疫苗，通过进一步降低免疫识别来提升翻译效率。
5-甲氧基尿苷（5moU）
尿嘧啶环上添加甲氧基，能同时减弱抗病毒信号和促炎信号（尤其在免疫细胞中）。
5-甲基胞苷（m5C）
胞苷的甲基化形式，可稳定RNA结构并提高翻译效率。
这些修饰核糖核苷经磷酸化后形成三磷酸核苷（NTPs），即可在IVT过程中掺入RNA链。
体外转录过程中掺入的化学修饰核苷酸（如假尿苷Ψ）可增强mRNA稳定性并降低免疫激活。这些取代在不改变编码序列的前提下替换了尿苷等天然碱基。
03
dsRNA检测的挑战
虽然修饰作用提升了mRNA疗法性能，却使IVT流程中重要杂质——dsRNA的准确定量复杂化。传统检测方法（如ELISA或HTRF检测）依赖识别特定RNA结构的抗体（如J2或K1）。但受修饰影响的RNA二级结构和序列可能改变抗体结合特性，导致dsRNA测量失准，引发给药剂量不当或安全隐患。
dsRNA的准确定量至关重要，其可接受阈值因应用场景而异：mRNA疫苗或容许较高dsRNA水平以支持免疫原性，而蛋白替代疗法则需严格限制以避免脱靶免疫反应。
04
更高灵敏度与特异性的解决方案
为应对这些挑战，Promega开发了Lumit® dsRNA检测试剂盒——一种基于生物发光原理、无需抗体的检测方案，能以高灵敏度和高特异性定量dsRNA。该技术通过专利dsRNA结合域与NanoBiT®萤光素酶偶联，规避了抗体方法的序列与结构偏好性。
关键的是，Lumit检测法已通过含Ψ、m1Ψ、5moU等常见修饰核苷酸的dsRNA标准品验证，可对修饰mRNA样本实现准确定量。为获得最佳结果，建议使用与待测mRNA治疗产品或疫苗修饰模式匹配的dsRNA标准品，确保检测结果真实反映终产物的dsRNA含量。
修饰核苷酸是提升mRNA疗法性能的关键工具，但也要求更周密的分析策略。Lumit® dsRNA检测试剂盒提供稳健、精准且耐受修饰的解决方案，助力开发者在不同治疗应用中更可靠地管控dsRNA。
如果您正在寻找更可靠的RNA生产过程中dsRNA检测方法，Lumit® dsRNA检测试剂盒提供了一种高灵敏度、不依赖抗体的解决方案，助您在mRNA疗法开发中精准检测dsRNA副产物。了解这种高效检测技术如何为各阶段质量控制决策提供支持。
参考文献：
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Liu A and Wang X (2022) The Pivotal Role of Chemical Modifications in mRNA Therapeutics. Front. Cell Dev. Biol. 10:901510. doi: 10.3389/fcell.2022.901510
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Kariko, K., Muramatsu, H., Ludwig, J., and Weissman, D. Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 21
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Kellie D. Nance and Jordan L. Meier. Modifications in an Emergency: The Role of N1-Methylpseudouridine in COVID-19 Vaccines. ACS Central Science 2021 7 (5), 748-756
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Moradian, H., Roch, T., Anthofer, L., Lendlein A., Gossen, M. Chemical modification of uridine modulates mRNA-mediated proinflammatory and antiviral response in primary human macrophages. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 2022. Vol 27. 854-869
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相关产品及资源
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产品 |
规格 |
目录号 |
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Lumit® dsRNA Detection Assay |
100 assays 500 assays |
W2041 W2042 |
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