【生工技术】来来来，认识一下pET-28a

从上图看，pET-28a是由多个部件组成的双链环状DNA，长度为5369 bp。对于一个原核表达质粒来讲，5 kbp的大小可谓寸土寸金。如果将质粒比喻为一辆细胞穿梭机，那么在其有限空间内，分布了多个零部件，这些基因元件虽说不是都很重要，但是它们的确各自发挥着功能。

对于pET-28a质粒来讲，值得介绍的基因元件有：

【1. Origin】

Origin的全称为the origin of replication，简称为replicon（复制子）。复制子是由复制的起始位点以及其调控元件组成。由于质粒需要在宿主体内存留，因此必须从Ori区域开始质粒的复制。Origin区域通常富含AT，由于AT的互补配对仅有两条氢键，因此在此位置开始解链不需要特别高的温度，解链之后，相关的复制机制开始发挥作用，负责质粒进行拷贝。

质粒的复制子有很多种，我们经常遇到的原核质粒中有ColE1, pMB1, pSC101, R6K, 以及15A等等。并不是所有的复制子都能够在宿主体内复制形成相同数量的质粒，有些复制出来的质粒很多而有些就很少。根据复制子调控机制的不同，可以分为“严谨型”和“松弛型”。

常见质粒的复制子名称以及拷贝数

（来自Plasmids 101 eBook）

从上图中可以看出，pET系列的质粒的复制子名称为pBR322，属于松弛型中低拷贝复制子，通常的拷贝数为12~20个/细胞。对于表达质粒来说，由于目的蛋白的高表达会对宿主细胞造成很大的代谢压力，因此表达质粒的拷贝数通常不是特别高。

除了复制子本身的性质，还有很多因素会影响质粒的拷贝数。比如：

1. 插入片段：

如果插入片段比较大，或者它本身的转录表达会对宿主有害（包括有毒性），质粒的拷贝数会下降；

2. 宿主细胞的种类：

以大肠杆菌为例，大多数的基因工程用大肠杆菌宿主都比较适合携带质粒，其中尤其以end-宿主，其非特异性核酸内切酶基因缺失，外源DNA更加稳定，更加适合质粒的复制；

3. 生长条件：

培养基的新鲜程度、通气程度、温度、抗生素等等都或多或少影响了质粒拷贝数，有些复制子是温度敏感型的，有些能通过添加氯霉素产生更多的拷贝。

【2. Rop基因】

这个基因关注的人并不多，但是正如前面提到，复制子是由很多相关蛋白调控的，Rop就属于一个复制调控蛋白，控制ori的复制数维持在大概15~20，如果删除ROP基因，质粒的拷贝数将飙升至在100以上。但pET系列质粒的拷贝数增加对蛋白表达并不一定是件好事。

【3. Kan基因】

Kan基因的全称为氨基糖苷磷酸转移酶，该基因的添加使得质粒具有卡那霉素抗性。卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，这种抗生素会与30s核糖体结合，导致RNA翻译紊乱。添加抗生素的目的就在于使未携带kan抗性质粒的宿主菌死亡，保证培养过程中的宿主都含有目标质粒。

下表是常用的抗生素作用机理

及推荐使用浓度

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