项目背景
1.1 生物学特性
副流感病毒（parainfluenza viruses，HPIV）隶属副黏病毒科（Paramyxoviridae），根据基因组特征及血清学特点，HPIV分为HPIV-1~4血清型，其中HPIV-1和HPIV-3为呼吸道病毒属（Respirovirus），HPIV-2和HPIV-4为腮腺炎病毒属（Rubulavirus）。HPIV在电镜下多呈球形，直径125~250nm，基因组约15500个核苷酸。其基因组可编码6种结构蛋白，如图1所示，包括核蛋白NP蛋白（nucleoprotein，NP）、磷蛋白P蛋白（phosphoprotein，P）、基质蛋白M蛋白（matrix protein，M）、血凝素-神经氨酸酶蛋白HN蛋白（hemagglutinin-neuraminidase protein，HN）、融合蛋白F蛋白（fusion protein，F）和大蛋白L蛋白（large protein，L）。HN蛋白和F蛋白位于HPIV包膜表面，这2种蛋白是中和抗体的主要靶标。M蛋白位于包膜内层，HPIV包膜内为核衣壳，NP蛋白包裹的基因组RNA作为转录的模板，L蛋白和P蛋白形成L-P RNA聚合酶复合体。P基因还编码部分非结构蛋白，这些蛋白在不同血清型间略有不同，HPIV-1 RNA编码C蛋白，HPIV-2和HPIV-4 RNA 编码V蛋白，HPIV-3 RNA编码C蛋白和D蛋白，这些非结构蛋白不是病毒复制的必需蛋白。HPIV感染宿主细胞时与宿主细胞膜融合，释放核衣壳，L-P RNA聚合酶复合体识别模板进行转录，经核糖体翻译为病毒结构蛋白。病毒的子代RNA与NP蛋白组装形成核衣壳，既可参与下一轮转录和翻译，也可与结构蛋白结合形成新的病毒颗粒释放到细胞外。
图1 HPIV全病毒结构示意图
1.2致病机制
HPIV主要侵犯呼吸道黏膜的表层组织，在纤毛上皮细胞内复制和繁殖。感染多从鼻和口咽开始，2~5 d后可延伸至下呼吸道并达到复制高峰。HPIV常侵犯<5岁婴幼儿的气管、支气管黏膜上皮细胞，引起细胞变性、坏死增生和黏膜糜烂。当侵犯肺泡上皮细胞及间质细胞时，则引起间质性肺炎，或表现为支气管炎或肺炎。HPIV-1和HPIV-2更易感染喉及气管上段，与急性喉气管支气管炎有关。而HPIV-3感染远端气道，与支气管炎和肺炎相关。HPIV-4一般感染上呼吸道，通常症状轻。由于婴幼儿免疫系统发育不完善，免疫应答能力相对较弱，抗体持续时间较短，故易发生反复感染。疾病的严重程度取决于HPIV的感染部位、病毒载量、型别及宿主自身免疫等因素。
1.3流行病学特征
HPIV感染呈全球性分布，造成严重的疾病负担，不同血清型在不同地区、不同年份的流行病学特征均有差异。HPIV是儿童呼吸道感染的主要病原体之一，中国疾控中心数据显示，2009-2020年成人及儿童急性呼吸道感染患者病毒阳性率最高为流感病毒（28.5%），其次是呼吸道合胞病毒（16.8%）、鼻病毒（16.7%）和HPIV（13.1%）。HPIV检出患者以5岁以下儿童多见，其中<2岁的儿童感染率最高。<5岁儿童中大约13%的急性呼吸道感染病例、4%~14%的急性下呼吸道感染住院病例和4%的急性下呼吸道感染死亡病例都归因于HPIV感染。HPIV感染主要以HPIV-1和HPIV-3为主，2011-2019年，美国HPIV阳性患者中各型别占比分别为18%（HPIV-1）、14%（HPIV-2）、55%（HPIV-3）和13%（HPIV-4），我国多项研究同样证实HPIV-3是最主要的血清型。
1.4 实验室检测
实验室检测对于HPIV感染的临床诊治具有重要指导意义，目前实验室常用的检测手段包括病毒分离培养、抗原检测、血清学抗体检测、核酸检测。不同检测方法各有其优势和局限性，需要根据不同需求合理选择应用（表1）。
建议对疑似呼吸道感染的门急诊患儿，应优先选择核酸检测，其中PCR方法应用最为广泛。为便于呼吸道病毒的鉴别诊断，可采用多重PCR方法。当不具备核酸检测条件时，可行抗原、抗体检测，若结果阴性且临床不能排除HPIV感染时，需采用核酸检测方法进一步确认。推荐强度：强推荐。
测试方案及性能表现
针对副流感病毒（HPIV1、2、3型）抗原的检测，西宝生物推出5种单克隆抗体、3种抗原及1种菌液，适合胶体金免疫层析、彩色乳胶免疫层析及荧光免疫层析平台。具体性能如下。
（以下评估仅代表在西宝生物的工艺体系下的验证，建议客户根据自身工艺进行抗体交叉配对验证）。
2.1 胶体金/彩色乳胶/荧光免疫层析平台抗体配对方式
2.1.1 HPIV-1抗体配对组合：副流感病毒（HPIV）1&3型抗体（货号：FKY0933D）标记胶体金/彩色乳胶/荧光微球+副流感病毒（HPIV）1型抗体（货号：FKY0933C）划膜。
2.1.2 HPIV-2抗体配对组合：副流感病毒（HPIV）2型抗体（货号：FKY0934C）标记胶体金/彩色乳胶/荧光微球+副流感病毒（HPIV）2型抗体（货号：FKY0934D）划膜。
2.1.3 HPIV-3抗体配对组合：副流感病毒（HPIV）1&3型抗体（货号：FKY0933D）标记胶体金/彩色乳胶/荧光微球+副流感病毒（HPIV）3型抗体（货号：FKY0935C）划膜。
2.2 HPIV抗原稀释
将HPIV-1抗原（货号：EKY0221B）/HPIV-2抗原（货号：EKY0221C）/HPIV-3抗原
（货号：EKY0221D）分别用合适的稀释液按照理论浓度依次稀释到如下测试浓度。
2.3 反应模式：80uL样品直接上样，反应时间15min-20min。
2.4 测试结果
2.4.1 HPIV-1测试结果
a.胶体金免疫层析平台：采用HPIV-1抗体配对测试HPIV-1抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达50ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在胶体金层析平台测试性能良好。
b.彩色乳胶免疫层析平台：采用HPIV-1抗体配对测试HPIV-1抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达10ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在彩色乳胶层析平台测试性能良好。
c.荧光免疫层析平台：采用HPIV-1抗体配对测试HPIV-1抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达5ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在荧光免疫层析平台测试性能良好。
d.特异性：分别测试浓度为10ug/mL的腺病毒抗原、合胞病毒抗原、2019-nCOV-SRFc3cho抗原、2019-nCOV-SRHcho抗原、HPIV-2抗原、HPIV-3抗原，结果均为阴性，表明特异性良好。
图1 胶体金层析平台测试HPIV-1抗原梯度示意图
图2 彩色乳胶层析平台测试HPIV-1抗原梯度示意图
表1 HPIV-1抗体配对荧光层析平台测试HPIV-1抗原梯度数据
|
样本编号 |
HPIV1抗原梯度（ng/mL） |
T |
C |
T/C |
区分度 |
|
1 |
2000 |
126583 |
159545 |
0.793 |
254% |
|
2 |
500 |
53853 |
172631 |
0.312 |
245% |
|
3 |
200 |
21510 |
169153 |
0.127 |
186% |
|
4 |
100 |
11268 |
164623 |
0.068 |
222% |
|
5 |
50 |
5946 |
192848 |
0.031 |
199% |
|
6 |
20 |
2511 |
161848 |
0.016 |
186% |
|
7 |
10 |
1300 |
155586 |
0.008 |
144% |
|
8 |
5 |
993 |
171710 |
0.006 |
229% |
|
9 |
1 |
696 |
174386 |
0.004 |
/ |
|
10 |
0 |
466 |
170499 |
0.003 |
/ |
|
11 |
0 |
406 |
175013 |
0.002 |
/ |
测试使用荧光仪器:和迈FIC-S100
2.4.2 HPIV-2测试结果
a.在胶体金免疫层析平台，采用HPIV-2抗体配对测试HPIV-2抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达20ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在胶体金层析平台测试性能良好。
b.在彩色乳胶免疫层析平台，采用HPIV-2抗体配对测试HPIV-2抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达1ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在彩色乳胶层析平台测试性能良好。
测试阳性菌液可出线，与抗原梯度20ng/mL接近。
c.在荧光免疫层析平台，采用HPIV-2抗体配对测试HPIV-2抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达1ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在荧光免疫层析平台测试性能良好。
测试阳性菌液荧光强度介于抗原梯度2ng/mL与5ng/mL之间。
d.特异性：分别测试浓度为10ug/mL的腺病毒抗原、合胞病毒抗原、2019-nCOV-SRFc3cho抗原、2019-nCOV-SRHcho抗原、HPIV-1抗原、HPIV-3抗原，结果均为阴性，表明特异性良好。
图3 胶体金层析平台测试HPIV-2抗原梯度示意图
图4 彩色乳胶层析平台测试HPIV-2抗原梯度示意图
图5 彩色乳胶层析平台测试HPIV-2抗原及菌液示意图
表2 HPIV-2抗体配对荧光层析平台测试HPIV-2抗原梯度数据
|
样本编号 |
HPIV2抗原梯度（ng/mL） |
T |
C |
T/C |
区分度 |
|
1 |
500 |
405857 |
96728 |
4.1959 |
199% |
|
2 |
200 |
379046 |
180004 |
2.1058 |
162% |
|
3 |
100 |
286829 |
221237 |
1.296 |
204% |
|
4 |
50 |
172366 |
270623 |
0.6369 |
264% |
|
5 |
20 |
72251 |
299455 |
0.2413 |
181% |
|
6 |
10 |
40945 |
307469 |
0.1332 |
212% |
|
7 |
5 |
20516 |
326757 |
0.0628 |
240% |
|
8 |
2 |
7905 |
302192 |
0.0262 |
158% |
|
9 |
1 |
5004 |
302325 |
0.017 |
187% |
|
10 |
0.5 |
2612 |
294925 |
0.0089 |
269% |
|
11 |
0.1 |
995 |
301995 |
0.0033 |
/ |
|
12 |
0 |
1526 |
284927 |
0.0054 |
/ |
|
13 |
阳性菌液 |
12242 |
316293 |
0.0387 |
148% |
测试使用荧光仪器:和迈FIC-S100。
2.4.3 HPIV-3测试结果
a.在胶体金免疫层析平台，采用HPIV-3抗体配对测试HPIV-3抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达10ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在胶体金层析平台测试性能良好。
b.在彩色乳胶免疫层析平台，采用HPIV-3抗体配对测试HPIV-3抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达5ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在彩色乳胶层析平台测试性能良好。
c.在荧光免疫层析平台，采用HPIV-3抗体配对测试HPIV-3抗原稀释梯度均显色，灵敏度可达1ng/mL。该实验结果表明此抗体配对在荧光免疫层析平台测试性能良好。
d.特异性：分别测试浓度为10ug/mL的腺病毒抗原、合胞病毒抗原、2019-nCOV-SRFc3cho抗原、2019-nCOV-SRHcho抗原、HPIV-1抗原、HPIV-2抗原，结果均为阴性，表明特异性良好。
图6 胶体金层析平台测试HPIV-3抗原梯度示意图
图7 彩色乳胶层析平台测试HPIV-3抗原梯度示意图
表3 HPIV-3抗体配对荧光层析平台测试HPIV-3抗原梯度数据
|
样本编号 |
HPIV3抗原梯度（ng/mL） |
T |
C |
T/C |
区分度 |
|
1 |
500 |
239432 |
137295 |
1.744 |
217% |
|
2 |
200 |
138840 |
172833 |
0.803 |
144% |
|
3 |
100 |
86753 |
155019 |
0.560 |
182% |
|
4 |
50 |
50523 |
164212 |
0.308 |
254% |
|
5 |
20 |
18566 |
153430 |
0.121 |
187% |
|
6 |
10 |
11061 |
170507 |
0.065 |
230% |
|
7 |
5 |
3662 |
130000 |
0.028 |
410% |
|
8 |
1 |
1175 |
171118 |
0.007 |
280% |
|
9 |
0 |
394 |
160472 |
0.002 |
/ |
|
10 |
0 |
381 |
149609 |
0.003 |
/ |
测试使用荧光仪器:和迈FIC-S100。
产品信息
|
产品名称 |
货号 |
推荐配对 |
|
副流感病毒1&3型（HPIV-1&3）单克隆抗体 |
FKY0933D |
HPIV-1:副流感病毒1&3型单克隆抗体（货号：FKY0933D）标记胶体金/乳胶/荧光微球+副流感1型单克隆抗体（货号：FKY0933C）划膜（胶体金/乳胶/荧光层析配对组合） HPIV-2:副流感病毒2型单克隆抗体（货号：FKY0934C）标记胶体金/乳胶/荧光微球+副流感病毒2型单克隆抗体（货号：FKY0934D）划膜（胶体金/乳胶/荧光层析配对组合） HPIV-3:副流感病毒1&3型单克隆抗体（货号：FKY0933D）标记胶体金/乳胶/荧光微球+副流感病毒3型单克隆抗体（货号：FKY0935C）划膜（胶体金/乳胶/荧光层析配对组合） |
|
副流感病毒1型（HPIV-1）单克隆抗体 |
FKY0933C |
|
|
副流感病毒2型（HPIV-2）单克隆抗体 |
FKY0934D |
|
|
副流感病毒2型（HPIV-2）单克隆抗体 |
FKY0934C |
|
|
副流感病毒3型（HPIV-3）单克隆抗体 |
FKY0935C |
|
|
副流感病毒1型（HPIV-1）抗原 |
EKY0221B |
|
|
副流感病毒2型（HPIV-2）抗原 |
EKY0221C |
|
|
副流感病毒3型（HPIV-3）抗原 |
EKY0221D |
|
|
副流感1&3型抗体（货号：FKY0933D）-胶体金浓缩液 |
DKY1339A |
|
|
副流感1&3型抗体（货号：FKY0933D）-乳胶浓缩液 |
DKY1339B |
|
|
副流感1&3型抗体（货号：FKY0933D）-荧光微球浓缩液 |
DKY1339C |
|
|
副流感2型抗体（货号：FKY0934C）-胶体金浓缩液 |
DKY1340A |
|
|
副流感2型抗体（货号：FKY0934C）-乳胶浓缩液 |
DKY1340B |
|
|
副流感2型抗体（货号：FKY0934C）-荧光微球浓缩液 |
DKY1340C |
|
|
副流感病毒2型（HPIV-2）室内质控品 |
EEI0330A |
|
|
胶体金（40nm，1OD） |
DXJ9917B-100ml |
|
|
红色羧基乳胶微球，400nm |
DEG0809A-10ml |
|
|
时间分辨荧光微球，羧基（200nm） |
AEG0786B |
|
参考文章
西宝生物作为体外诊断上游原料综合供应商，全方位助力IVD试剂盒开发，可为客户提供呼吸道项目多指标检测原料，其他相关产品请参考
1.人偏肺病毒（hMPV）抗原检测-免疫层析 （胶体金、彩色乳胶及荧光免疫层析）解决方案
2.呼吸道合胞病毒（RSV）-免疫层析（胶体金及彩色乳胶）解决方案
3.腺病毒抗原（HAdV）-免疫层析（胶体金及彩色乳胶）解决方案
4.甲乙流感病毒(Influenza A & B)抗原检测用原料
5.新型冠状病毒肺炎检测整体解决方案
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