发生这个问题的根本原因在于检测线区域每单位面积内捕获试剂浓度过低。有很多可能的原因会导致这一结果的发生。

一、产生原因

1、所用溶液中捕获试剂浓度过低。

2、捕获试剂未能很好与膜接触，因此在样品经过时被洗脱。电泳缓冲液中(或由“流动中的封闭”引入)高浓度的表面活性剂能导致捕获试剂从膜上释放出来。一些捕获试剂与硝酸纤维素膜的结合本身就很微弱。

3、膜的侧向流爬速过高。捕获试剂加入后将在膜内弥散。发生在固相表面的分散需要一定时间,膜的侧向流爬速越高，在一定时间内蛋白移动便越远，因而在横向和纵向上所形成的线都越宽。而后者可导致更多的捕获分子无法形成信号。这由于结合物仅在距膜表面10pm的范围内才能产生可视的信号。横向和纵向的共同毛细作用使得检测线变弱。

4、微弱的捕获线也见于抗体和可疑待测物间的亲和常数过低的情况。

二、补救方法

1、使用较高浓度的捕获试剂。不建议通过增加体积来增加捕获蛋白量。

2、使用孔径更小的膜。这可以通过以下三个方面增加检测线的锐利度和强度。第一，膜孔径越小，比表面积越大，蛋白结合能力越强，捕获蛋白的结合数量越大。第二，孔径越小，爬速越小，测试线越锐利。第三，样品流速越小，影响待测物表观浓度越显著。

3、降低爬速。使用粘度调节剂(如蔗糖)将减轻检测线的弥散。

4、换用不同的膜。不同的膜有不同的结合特性。更换另一种膜，或许能大大增加捕获分子的结合能力。

5、改变所使用的缓冲液。

6、捕获分子与膜的交联。如果捕获分子不能与硝酸纤维索膜发生良好的非共价结合，可以选用交联试剂。使捕获分子在应用前与载体蛋白(常用的有BSA或KLH)交联，或之后与直接交联。在后一种情况下，需保证在检测前所有反应组分都得到有效封闭。在戊二醛作为交联剂的情况下，可使用硫酸铵进行洗涤。