法医DNA分型的发现使分子生物学的发展远远超出了法医应用的预期范围，而如今分子生物学的其他发展也已准备好应用于法医挑战。这样的挑战之一就是如何识别体液中的污点。
从证据项目和犯罪现场中恢复。 当前，在研究领域中进行了巨大的努力来开发用于体液分子鉴定的新方法，其中miRNA展现出巨大的潜力。由于miRNA的片段小、不易降解、有较高的组织特异性，是潜在的法医研究样本。
文章中作者研究了QIAGEN miRNeasy Mini Kit、Thermo mirVana miRNA isolation kit及一种实验室在mirVana基础上的改良版三种试剂盒针对静脉血、经期血、精液、唾液、阴道分泌物5种样本的miRNA分离差别。结果：
1. 最佳提取方法
这项研究的首要目的是研究使用两种商业试剂盒与法医相关的体液一起使用的三种miRNA分离方法。使用三种提取方法中的每一种对五种体液提取物中每种提取物的定量结果表明，迷你试剂盒可产生始终如一的高产量提取miRNA（表1）。
表1 提取物定量结果
使用miRVana™miRNA isolation kit从静脉血中获得的产量在所有10个样品中均保持一致，但远低于使用miRNeasy ® mini Kit采集的产量。改良的miRVana™方法产生的产率比直接的miRVana™试剂盒更高，但是，十个样品中有两个样品的产率更高，因此偏离了标准偏差。使用三种提取方法中的每一种对月经血液，精液，唾液和阴道材料提取物的定量结果表明，与其他两种方法相比，miRNeasy®mini kit提取miRNA产量更高。
应该注意的是，使用miRNeasy®mini kit获得的产量在样品内和体液中变化很大，但是始终高于其他两种提取方法。事实证明，miRNeasy®mini kit在所有测试的体液中均具有最高的平均产量，但唾液除外。改良的miRVana™方法的唾液的平均产量略高。
2. RT-qPCR验证miRNA
针对每种体液中的特定miRNA进行了RT-qPCR。在静脉血和月经血中检查miR-451的表达。与月经血样品相比，两项T检验发现静脉血样品中的miR-451表达显着失调（图1 ）。
图1 静脉血样品中的miR-451表达
这项研究的目的是首先使用所研究的方法确定从法医相关体液中提取miRNA的最佳方法，其次是验证以前在这些体液中报道的miRNA。
虽然有几种可用的商用miRNA提取试剂盒（RNeasy®Micro Kit（Qiagen），miRNeasy®Mini Kit（Qiagen），mirVana™miRNA isolation Kit（Applied Biosystems）和RNAqueous®microKit（Ambion）），所有这些试剂盒设计用于临床样品，例如组织和培养的/原代细胞。因此，至关重要的是，将一些试剂盒与法医相关的体液进行比较。在这项研究中，使用三种不同的提取方法从静脉血，经血，精液，唾液和阴道材料中分离出miRNA。
miRNeasy®miniKit（Qiagen），miRVana™ isolation Kit（Ambion）和内部的改良版。虽然有几种商业miRNA提取试剂盒（RNeasy®MicroKit（Qiagen），miRNeasy®Mini Kit（Qiagen ），mirVana™ miRNA isolation Kit（Applied Biosystems）和RNAqueous®Micro Kit（Ambion）），所有这些试剂盒均设计用于临床样品，例如组织和培养的/原代细胞。因此，至关重要的是，将一些试剂盒与法医相关的体液进行比较。在这项研究中，使用三种不同的提取方法从静脉血，经血，精液，唾液和阴道材料中分离出miRNA。miRNeasy® mini kit（Qiagen），miRVana™ isolation kit（Ambion）和in-house modified version of the miRVa，发现miRNeasy Mini Kit对于上述样本的RNA得率均明显高于其他两个试剂盒。
好物推荐
使用miRNeasy Mini Kit纯化含有miRNA的总RNA，可用于与管家基因或其他目的mRNA进行miRNA表达水平的直接比较。对于某些比较灵敏的下游应用，还需要富集得到不含有大分子RNA的miRNA组分。miRNeasy Mini Kit可高效富集至少含18个核苷酸以上的RNA。相比于使用其他试剂盒纯化的样本，使用miRNeasy Mini Kit纯化后的小RNA更清晰可见。
miRNeasy Serum/Plasma Kit可从至多200 µl血清或血浆中有效纯化RNA。miRNeasy Kits制备的RNA纯度高，可直接用于敏感的下游应用。miRNeasy操作流程将盐或苯酚污染的可能性降到最低。
miScript SYBR Green PCR Kit配合miScript PCR System的组件，灵敏和特异性的检测和定量miRNA。miScript PCR System灵敏度高、动态范围广。持续高的扩增效率，确保使用∆∆C T方法进行多个miRNAs表达分析结果的准确性。
miScript II RT Kit配合miScript PCR System的其他组分，灵敏和特异性地检测并定量miRNA。由于许多miRNA表达水平低，灵敏度特别重要，以确保数据的可靠。miScript PCR System灵敏度高、动态范围广和持续高扩增率。
在血清或血浆样本中miRNA表达谱使用什么作为内参，目前在研究学者间还没有明确共识。很多研究者选择将合成的miRNA导入RNA样品中，以帮助监测RNA回收率和反转效率。QIAGEN推荐miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control作为血清或血浆miRNA表达谱的内参。miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control是C. elegans miR-39 miRNA类似物，使用miScript PCR System配合Ce_miR-39_1 miScript Primer Assay（miRNeasy Serum/Plasma Kit中提供）通过RT-PCR可轻松检测。miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control需单独订购。试剂盒中提供的Ce_miR-39_1 miScript Primer Assay需与miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control配合使用。
