错配修复异质性缺失(MMR)蛋白表达：免疫组化和微卫星不稳定性(MSI)评估的挑战 Topic 

研究要点

这篇发表于2019年The Journel of Pathology Clinical Research杂志上的文章主要研究了错配修复(MMR)蛋白的免疫组化(IHC)用于鉴定MMR状态：弥漫性阳性(完整 / 保留细胞核染色)或核肿瘤染色缺失(MMR蛋白缺失)。经NGS鉴定4例结肠腺癌和1例伴有异型增生的胃腺癌在四种MMR蛋白中至少有一种呈现异质性IHC染色状态。为了探讨这些染色状态的潜在分子机制，对相应区域进行了宏观解析、微卫星不稳定性(MSI)分析以及MLH1、MSH2、MSH6和PMS2基因的NGS和多重连接依赖探针扩增(MLPA)分析，包括MLH1甲基化分析。

在5例MMR蛋白丢失的病例中，有4例是MSI-H的。异质性的MMR- IHC 并不总是由于人为判断所致，与丢失区域的高度微卫星不稳定状态有关。

患者信息

这篇文章中的研究的病例是基于2015年至2017年期间所有接受MMR检查的胃肠道肿瘤中发现的不寻常的异源性样本而选择的，共进行了389例结直肠癌切除手术。在389例患者中，有4例大肠腺癌 (例1-4) 及1例 (例5) 同时患有胰腺癌和胃腺癌的患者由于其存异质性MMR免疫组学现象，作为本次研究的案例。

审查所有切除标本的HE染色切片。记录肿瘤类型、分级/分化等多项参数。根据美国癌症联合委员会(AJCC)第7版pTNM癌症分期手册对病例进行病理分期。

IHC（MLH1、PMS2、MSH2和 MSH6) 取材于石蜡包埋组织切片,使用抗体: MLH-1，MSH-2，MSH-6和PMS2。所有四种抗体的预处理方案都相同：热诱导表位修复，染色。

瘤旁正常结肠隐窝上皮、淋巴样细胞和间质细胞作为内阳性对照。

异质性染色的肿瘤表现为腺体内的异质性(强免疫反应细胞与阴性细胞混合)和/或带状缺失(涉及多个相邻腺体的融合区域的染色缺失)。使用相同的区块在每个病例上重复两次IHC。根据上述方式标记为MMR异质性的所有病例中，肿瘤细胞的核染色明显消失，而正常间质和淋巴细胞在同一区域显示较强的核染色。

病例1-4，对正常组织和大肠腺癌患者的两个肿瘤区域进行了MSI分子检测。对MMR-IHC染色不均的肿瘤区分别进行大体解剖，使每例保留IHC的肿瘤区和缺失的肿瘤区分别进行MSI和NGS检测。病例5，对正常组织、胰腺肿瘤、胃腺癌和胃非侵袭性胃不典型增生/腺癌进行了分子检测。对所有病例的正常组织和大体解剖肿瘤区域的MSI分子检测结果进行了比较。

用Maxwell 16 FFPE LEV DNA纯化试剂盒(Promega)提取的基因组DNA进行MSI分子测试。MSI分子测试由一个用于评估MSI的多重PCR 5个微卫星单核苷酸标记(NR-21、BAT-26、BAT-25、NR-24、Mono-27)和两个主要用于检测潜在污染的五核苷酸标记(Penta C、Penta D)组成(MSIAnalysis System Version 1.2；Promega)。扩增片段用毛细管电泳法分离，用数据分析软件分析。如上所述，MSI分子分析是在所有病例的正常组织和两个肿瘤区域上进行的，并将正常组织和大体解剖的肿瘤区域之间的标记重复进行比较。MSI被定义为与正常样本中的同一标记相比，最高峰位移位超过两个碱基对。五个单核苷酸标记中有两个或两个以上的不稳定性被归类为MSI-H，一个单核苷酸标记的不稳定性被归类为MSI-L，无不稳定的被归类为MSS。

对1-4例的正常组织和两个肿瘤区域进行NGS测序。对MMR IHC染色不均的肿瘤区域分别进行大体解剖，使IHC保留和IHC缺失肿瘤区域均接受NGS测序。对第5例正常组织、胰腺肿瘤、胃浸润性肿瘤和胃非侵袭性增生粘膜进行了NGS测序。所有病例均按上述方法提取基因组DNA，并对正常组织和两个肿瘤区域进行NGS。

52个癌症相关基因，包括 MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2，在NGS仪器上进行双端测序。

对2例(案例2和案例4)的两个肿瘤区域进行Sanger测序。

循环条件为94℃变性1min，95℃变性30s，55℃ 30s，72℃ 1min循环35次，72C最终伸长率为5min。数据结果使用序列分析软件进行分析。

为了鉴定外显子缺失和重复，在大体解剖的肿瘤标本上进行多重连接依赖性探针扩增（MLPA），包括进行甲基化特异性MLPAFormlH1甲基化分析，使用数据分析软件进行分析。病例 1 和 3 MLPA 采用探针MLH1 (P003) ，病例1和2 采用探针PMS2 (P008)，病例4和5 采用探针MSH6 (P072)，病例1和3 采用探针甲基化 (ME011) 评估 MLH1 启动子区域甲基化程度。

组织学参数和pTNM分期如表2所示。所有4例大肠腺癌均为直肠癌，其中3例高分化，1例低分化。粘液分化2例(间质细胞外粘液含量>10% 但<50%)，案例5为浸润性胰腺导管癌和胃腺癌，并伴有粘膜表面高度不典型增生。

MMR IHC染色的异质性(至少10%的肿瘤中存在异质性)，在2%的结直肠癌切除(233例中有5例)中存在该现象，表3概述了MMR免疫组织化学结果。

病例1显示MLH1和PMS2的不均匀染色，MSH2和MSH6蛋白的完整染色(图1)，其余3例(例2、3、4)均显示一种MMR蛋白完全缺失和/或异质染色：MLH1、PMS2或MSH6，其余三种MMR蛋白染色完整。

病例2显示MLH1完全缺失，PMS2染色不均匀(图2)；病例3 MLH1染色不均匀；病例4 MLH1和PMS2完全缺失，MSH6染色不均匀(图3)。

病例5的MMR IHC表现为：胰腺癌MMR蛋白全部保留；胃癌MLH1和PMS2蛋白缺失，MSH2和MSH6蛋白保留(如图4)。

MSI检测结果如表4所示。在病例1 (MLH1和PMS2的异质性MMR IHC)中，IHC保留区域的癌细胞为微卫星稳定(MSS)，而IHC缺失区域为MSI-H。

病例2和病例4(PMS2和MSH6分别为异质性MMR-IHC)在IHC保留区和缺失区均为MSI-H，病例3(MLH1为异质性MMR-IHC)在IHC保留区和缺失区均为MSS。
   病5例中，胰腺导管腺癌为MSI-L，MMR-IHC保留区为MSS，MMR缺失区为MSI-H，浸润性胃腺癌和胃增生异常灶为MSS，MMR-IHC保留区为MSI-H，MMR-IHC保留区为MSI-H，MMR缺失区为MSI-H。

表4概述了MLH1、PMS2、MSH2、MSH6和MLH1启动子甲基化分析的结果。NGS在五例病例的正常组织中未发现任何Lynch综合征相关的种系变异。

病例1中，在肿瘤中未检测到变体（异质性MLH1和PMS2蛋白染色；在MLH1免疫组化染色丢失的区域发现MLH1启动子高甲基化）。

在病例2中，肿瘤区域存在MSH6变体和两个PMS2错义变体存在PMS2表达，表现出MSI-H。在PMS2表达缺失的区域（也是MSI-H），同时存在两种MSH6形式。此外，MLPA分析未检测到PMS2基因的外显子del或dup。

在病例3中，MMR蛋白保留病灶和丢失病灶的MLH1启动子甲基化分析均正常。

在案例4中，在IHC阳性和IHC阴性肿瘤区域（异质性MSH6 IHC染色，两个区域均为MSI-H）都存在2种MSH6MSH6突变。

在病例5中，胃腺癌和胃异型增生中均存在相同的MSH6，但在表面异型增生（均为MSI-H）中也存在额外的MSH6突变。在胰腺浸润性导管腺癌（MSI-L）中未检测到MSH6突变。

Sanger测序证实病例2、4和5中存在MSH6变体，如图6所示。

MMR缺乏表面上通过3种主要机制发生：

（1）MMR基因的体细胞高甲基化，最常见的是MMH-1；

（2） 一种遗传的MMR基因突变，以Lynch综合征为代表；

（3）染色体双体细胞突变。

结直肠癌中MSI状态的鉴定具有重要的临床意义，因为它有助于识别有Lynch syndrome风险的患者，并为患者提供预后和治疗信息。与MSS癌症患者相比，患有MSI-H的结直肠癌患者的预后有所改善。

肿瘤表现出异质性染色区域（MMR IHC 染色缺失/混合/强烈和弥漫性保留 MMR 蛋白的区域）不应被视为MMR IHC 完整/保留的病例或人工误差。尤其是 MSH6在肿瘤中经常发生异质性，但是如果 MSH2 蛋白是完整的（并且没有观察到异质性），那么林奇综合征是极不可能，这些病例应通过进一步进行分子分析，包括 MSI 和及测序。