液体生物样本ccfDNA的富集与纯化
以及生物标志物的检测
游离DNA提取
介绍
使用循环游离 DNA(ccfDNA) 作为癌症生物标志物的一个主要障碍是获取纯化样本的困难。来自基因组 DNA(gDNA) 的污染可能会影响ccfDNA的含量，并对关键突变的敏感检测产生影响。Promega使用ProNexTM Size Selective 纯化系统演示了即使在高度污染的样品中也可以高效去除gDNA。这种方法可以用于浓缩生物液体样本，以改善对稀有遗传事件（如微卫星不稳定性）和关键致癌基因突变的检测。
使用三例结直肠癌肿瘤患者的血浆样本，比较微卫星不稳定性（MSI）分析和FFPE 和ccfDNA中的NGS变异检测。
方法
从三名患有结直肠腺癌（分别标记为A、B、C）的个体中获得了匹配的正常相邻FFPE组织、肿瘤FFPE组织和血浆样本。按照下图中所示流程进行样本核酸提取和MSI分析。
基于扩增的 DNA 定量
使用ProNex DNA QC试剂盒系统测量DNA浓度。该系统是一种基于qPCR的方法，具有针对人类DNA的目标片段（长度为75、150和300 bp）以及内部阳性对照。使用150bp目标片段进行DNA定量分析。
结论：从石蜡样本和血浆样本中高效提取DNA。每个样本都获得了足够的可扩增的、大于 150bp 的 DNA 进行 MSL 和测序。
DNA 质量与大小
每个样本中75bp到300bp扩增产物的比例用于估计DNA完整性。ccfDNA 和FFPE 样本类型具有高度碎片化的样品。对DNA完整性的分析对于准确针对下游应用的输入模板量很重要。
上图：图A. 用于表征 DNA 完整性的 DNA 质量控制试验的图解。B. 通过多重实时荧光定量 PCR 测得的单个个体中 75 到 300 base-pair 的扩增产物的代表性比值。C. 在具有或不含有大小选择的情况下，ccfDNA 的平均 75/300 倍比。每种条件有 3 个。D. 使用 Agilent TapeStation 和 D1000 高灵敏度筛网带运行样品的代表电泳图。
结论：DNA 质量控制试验中使用的 75/300 基对扩增片段比可以估计 DNA 的完整性。大小选择可减少 ccfDNA 中大分子 DNA 污染。
MSI 分析
使用两种 MSI 分析系统，从肿瘤组织、正常相邻组织以及循环游离 DNA 中提取的 FFPE 样本进行微卫星不稳定性分析。
箭头表示一个新的单核苷酸峰(最大高度>500bp)，与正常组织相比存在的等位基因偏移超过2bp
使用选择大小的ccfDNA从所有三个样本中获得了完整的MSI概况。在ccfDNA中未发现MSI，这可能是因为这些肿瘤都是局部局限性的，并且可能脱落DNA含量不够（AB样本为1A期，C样本为3A期）。
结论：使用两种MSI分析系统对FFPE和ccfDNA样本进行MSI分析是成功的。
NGS质量
使用 Illumina 的 TruSeq Custom Amplicon Low Input Kit 进行了二代测序。
使用定制的TruSeq Amplicon Assay对每个样本进行了成功的分组对9个基因进行全外显子测序，平均覆盖率为89%，432个扩增子，目标长度为33,000bp。
结论：成功对石蜡包埋样本和循环游离 DNA 样本进行了靶向外显子测序。
变异检测
使用Illumina TruSeq Custom Amplicon 应用程序在BaseSpace测序中心进行了序列分析。
A. 单核苷酸多态性对比较：每个组织中的所有单核苷酸多态性 (SNV) 的一对比较。使用 BaseSpace评估工具进行分析。
B. 肿瘤变异读取频率：体细胞变异被定义为正常对照组织中不发生变异，并且总读深度大于500。所有体细胞突变的平均体细胞变异读取频率（以总读数的分数表示），归一化到总读数深度。
C. 样本中检测到的生殖系变异：在正常和肿瘤FFPE样本中检测到超过15%的常染色体变异。
结论: 在循环游离 DNA 中可以检测到生殖系特异性和肿瘤特异性变异。
文献支持
https://www.jmdjournal.org/article/S1525-1578(16)30221-5/fulltext
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产品信息
Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit
Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit（AS1840）是一款用于自动化纯化循环游离DNA（ccfDNA）或循环肿瘤DNA（ctDNA）的试剂盒，与Maxwell® RSC系列仪器配套使用，能够从0.2至1.0毫升的小体积血浆样本或2至8毫升的大体积血浆中高效提取ccfDNA。此试剂盒设计了简单易操作的三步或五步纯化流程，大大减少了预处理步骤，使得科研人员能够快速、方便地获得高质量、可扩增的ccfDNA。
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目录号 |
规格 |
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AS1480 |
<1ml |
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AS1840 |
Large Volume |
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仪器信息表
所有Maxwell®核酸提取仪系列分为1-24通量和1-48通量两种型号的仪器，都带有去污染的紫外线灯和平板电脑的配置。同时可根据需求选配核酸定量用的荧光计仪器QuantusTM Fluorometer。
我们为任何Maxwell®仪器和试剂提供技术服务。如需要更多仪器信息和购买仪器，请拨打下方电话与我们联系。
010-58256268
