腺相关病毒 (AAV) 载体是神经系统疾病基因治疗研究中常用的载体，它们在静脉内全身给药后能够穿过血脑屏障并转导脑细胞，这一特性取决于AAV-PHP衣壳受体Ly6a。在设计新型重组AAV衣壳、改善组织兼容性和提高临床上转导效率等方面，科学家们已经取得了很多进展。随着更多样化的基因治疗载体的出现，迫切需要开发可用于测量复杂组织中的病毒转导的准确和快速的量化技术，以确定给定病毒制剂的转导效率，以及对不同脑细胞的转导趋向性。然而，人工估计AAV转导效率可能存在偏差且非常耗时，传统共聚焦成像方法能够获取免疫组织化学标记组织的高分辨率图像，但量化方法仍然存在样本间偏差，且批量处理时耗时依然很久。高内涵筛选 (HCS) 系统为细胞的荧光和形态学定量提供了一个强大、快速、可靠的平台。
发表于《Brain Communications》杂志的名为“Use of high-content imaging to quantify transduction of AAV-PHP viruses in the brain following systemic delivery”的研究利用PerkinElmer的Opera Phenix高内涵筛选系统开发了一种自动化方法来量化小鼠大脑中的转导效率。
Step 1
作者首先使用高内涵自动成像来捕获整个大脑部分的信号（图1A）。使用40倍镜头进行全玻片扫描，视野之间设置10%重叠，并用Harmony软件对多个视野进行无缝拼接，Z轴以1.2μm的间隔扫描19张图像，可以涵盖整个组织的厚度（图1A）。用3个荧光通道成像：Hoechest 33342（细胞核）、Alex 488（AAV-PHP 转导细胞 (GFP+)）、Alex 561（神经元 (NeuN+)）（图1B）。然后使用Harmony软件进行分析，通过细胞核识别、细胞质区域识别、计算荧光强度、通过阈值筛选细胞等步骤，分别筛选出NeuN+细胞，GFP+细胞和NeuN+ GFP+细胞（图1B）。作者为了进一步的去除假阳性细胞，还使用了STAR形态分析和机器学习算法，反复训练Harmony软件，最终成功的筛选出了NeuN+细胞，GFP+细胞和NeuN+ GFP+细胞（图1B）。
结果显示C57BL/6J和CBA/Ca 小鼠之间神经元的细胞百分比没有差异，整个大脑中大约40%的细胞被鉴定为两种近交系中的神经元（图1E）。在C57BL/6J小鼠大脑中大约14%的细胞中可以检测到GFP信号，而CBA/Ca小鼠大脑中基本检测不到GFP细胞，证明了AAV-PHP转导系统的特异性。来自同一小鼠大脑的切片之间的统计误差很小（图1F）。
图1. 构建量化AAV转导效率的自动分析方法
Step 2
接下来，作者配合R，对整个大脑进行区域分割，分别计算各个区域的荧光强度，以确定大脑区域的AAV-PHP的转导效率：先从Harmony软件中导出了单细胞分析结果，包括每张组织切片NeuN+、GFP+或 NeuN+/GFP+细胞类群，这些结果包含了每个细胞细胞核的Hoechst 信号和该细胞在孔中的位置坐标信息；然后使用x和y坐标以图形格式重建大脑部分（图2A）；使用R中的门点工具（gatepoints tool）绘制皮质、纹状体和海马体（图2B和C）。然后导出这些区域内的数据，以便确定神经元的比例和转导效率。
图2. 按结构区域分割全脑数据
与全脑数据一致，C57BL/6J和CBA/Ca小鼠在任何脑区的神经元 (NeuN+) 百分比没有差异。在皮质中，NeuN+神经元约占Hoechst+细胞的60%，而在纹状体和海马体中，这一比例接近40%（图3D）。纹状体和海马体数据在小鼠之间比皮层数据变化更大，但NeuN+细胞的百分比在所有ROI的同一小鼠大脑切片中非常一致（图3E）。C57BL/6J小鼠的所有三个大脑区域的细胞转导率约为15%，并且在所有情况下，CBA/Ca小鼠都没有GFP信号（图3F）。
图3. 分析大脑不同区域的 AAV-PHP.B 转导效率
这篇研究提供了一种非常有用的工具，可以用来快速评估新设计的AAV系统的靶来源于优宁维药物研发官网向性和效率，也可用来研究大脑或不同组织中指定细胞的转导效率。该方法也可推广到更广泛的组织学相关应用之中。
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