VHL蛋白（pVHL）通过调节HIF1α和Akt等蛋白底物的降解或激活而发挥肿瘤抑制作用。本文中，作者揭示了细胞周期素依赖性激酶1（CDK1）和肽基脯氨酸顺反异构酶1（PIN1）作为pVHL的调节因子，在三阴性乳腺癌症（TNBC）在内的多种野生型VHL的癌症中调节pVHL的稳定性及促进肿瘤进展的分子机制，并探索它们在治疗包括TNBC在内的野生型VHL癌症中的治疗潜力。

作者通过对cBioPortal癌症基因组数据库中收集的乳腺癌中的VHL改变进行分析发现，VHL基因在乳腺癌症中主要是野生型。然而，pVHL在TNBC组织中的表达显著低于正常乳腺组织,证实了pVHL在TNBC中的抑制作用（图1A）。且VHL的过度表达显著降低了MDA-MB-231细胞以及对顺铂和紫杉醇敏感的细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而VHL的敲除显著显示出相反的效果（图1B–G）。为了鉴定TNBC中pVHL的调节因子，作者使用稳定表达FLAG-VHL的MDA-MB-231细胞进行串联亲和纯化和质谱分析，确定了肽基脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用1（PIN1）为潜在的pVHL相互作用蛋白（图1H-J）。

图1

作者进一步研究PIN1在pVHL调节中的作用发现，在MDA-MB-231和BT-549中，PIN1的敲除和ATRA处理增加了MDA-MB-231和BT-549细胞的pVHL的蛋白质水平，但均不处于转录水平（图2A-D）。此外，通过基因消融或药物抑制靶向PIN1可以显著稳定TNBC中的pVHL（图2E,F）。为了验证PIN1是否会通过影响pVHL泛素化以破坏其稳定，作者进行了泛素化测定发现，在PIN1缺乏和ATRA处理的细胞中观察到多泛素化的pVHL的显著降低。单独敲除PIN1或WSB1降低了pVHL的泛素化水平，而PIN1和WSB1的组合敲除并没有进一步降低，这表明PIN1可能以依赖WSB1的方式调节pVHL泛素化。PIN1可以促进WSB1-pVHL的相互作用，从而增加TNBC中pVHL的泛素化和蛋白酶体依赖性降解（图2H-J）。

图2

接下来，作者通过研究PIN1在TNBC中的促肿瘤功能是否由pVHL介导发现，MDA-MB-231和BT-549细胞中PIN1的缺失显著增加了pVHL水平，同时显著降低了HIF1α和Akt磷酸化水平（图3A-D）。PIN1会破坏TNBC中pVHL的稳定性，从而激活其下游信号通路，如HIF1α和Akt。PIN1的减少在体外显著减少了MDA-MB-231和BT-549的细胞增殖、迁移和侵袭，而VHL的减少则显著恢复了这一点。当用ATRA处理细胞时，观察到类似的结果（图3E、F）。此外，ATRA的治疗显著增加了细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性，而VHL的耗竭可以挽救这种效应（图3G，H）。异种移植试验的结果表明，ATRA抑制肿瘤生长并增加对顺铂的敏感性，这在很大程度上被VHL的减少所消除（图3I、J）。这些结果表明，PIN1在体外和体内至少部分通过影响pVHL的稳定性来促进TNBC的肿瘤进展。

图3

作者通过使用CDK底物抗体观察了脯氨酸对FLAG-VHL的磷酸化作用发现，pVHL-PIN1的作用需要pVHL在Ser80-Pro81基序的磷酸化（图4A-D）。作者研究了Ser80对pVHL泛素化和降解的影响发现，这种磷酸化对于PIN1使pVHL不稳定至关重要（图4E-H）。作者进一步研究PIN1对pVHL抑制作用的影响是否取决于这种磷酸化，结果表明pVHL在Ser80的磷酸化对于通过破坏pVHL的稳定来促进肿瘤进展至关重要（图4I-L）。

图4

为了鉴定在Ser80磷酸化pVHL的特异性激酶，作者使用脯氨酸定向激酶的不同抑制剂来治疗MDA-MB-231细胞，结果发现CDK1（Carna Biosciences）抑制剂RO-3306显著增加了pVHL水平，而CDK2的减少对其没有影响，表明pVHL和CDK1之间的直接相互作用（图5A-C）。作者评估了CDK1对pVHL磷酸化的影响发现，减少CDK1或药理学抑制，pVHL的磷酸化显著降低。活性CDK1可以在体外磷酸化GST-pVHL-WT，但不能磷酸化S80A突变体（图5D，F）。RO-3306对CDK1的抑制显著降低了PIN1pVHL之间的相互作用（图5G，H）。这些发现证明了CDK1磷酸化pVHL的Ser80。

图5

作者进一步研究发现，CDK1的缺失或抑制可以增加TNBC细胞中pVHL的蛋白水平（图6A-D），而不会影响其mRNA水平。此外，pVHL在用RO-3306处理的细胞中更稳定（图6E）。接下来作者研究CDK1对pVHL泛素化的影响。在CDK1缺陷细胞或用RO-3306处理的细胞中观察到多泛素化的pVHL的显著降低，这可能是由pVHL和WSB1之间的相互作用降低引起的。RO-3306的处理显著降低了多泛素化的VHL WT，但不影响S80A或S80D的泛素化。CDK1的缺失显著增加了其他类型癌症细胞中的pVHL水平，包括黑色素瘤、胰腺癌、结直肠癌、卵巢癌症和其他类型的人类乳腺癌（图6F-L）。总之，CDK1可以磷酸化和破坏多种野生型VHL癌症中的pVHL的稳定性。

图6

作者研究了CDK1是否通过破坏pVHL的稳定而导致TNBC的恶性进展，结果发现CDK1通过破坏含有野生型VHL的癌症中pVHL的稳定性来促进肿瘤进展。通过进一步研究发现PIN1和CDK1协同破坏pVHL的稳定，从而促进TNBC的肿瘤进展。总之，该研究证明了PIN1/CDK1协同破坏pVHL稳定和促进肿瘤进展的新机制，因此靶向PIN1和CDK1可能是治疗TNBC和其他野生型VHL癌症的潜在治疗策略（图7）。

图7

Chen J, Li M, Liu Y, et al. PIN1 and CDK1 cooperatively govern pVHL stability and suppressive functions. Cell Death Differ. 2023 Apr;30(4):1082-1095. doi: 10.1038/s41418-023-01128-x.

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