程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)在抑制抗肿瘤免疫反应中起着重要作用。以PD-1为靶点的免疫检查点抑制剂(ICIs)治疗癌症已被批准用于治疗多种癌症。本文作者开发了一种高效的杂交瘤制备和筛选策略（图1）。

该工作流程包括4个主要步骤，包括：(1)小鼠抗PD-1杂交瘤克隆株的产生，(2)筛选产生抗PD-1中和抗体(NAbs)的小鼠杂交瘤克隆株；抑制PD-1和PD-L1相互作用，(3)小鼠抗PD-1 NAbs的制备和特性研究和特性研究，(4)小鼠/人嵌合抗PD-1 NAbs的产生、制备和特性研究。

图1

作者采用了两种形式的免疫原进行免疫，通过多种途径和两种小鼠品系来增加激活强效PD-1中和B细胞克隆的机会。BALB/c或ICR小鼠（每个品系4只小鼠）通过SC、IM和IP用重组hPD-1 Fc嵌合蛋白（蛋白组，P）免疫，或通过IP用表达hPD-1的CHO-K1细胞（细胞组，C）免疫(见图2a)。选择产生最高滴度的ICR小鼠用于最终免疫并取脾进行杂交瘤培养。

图2

作者使用细胞电融合技术进行杂交瘤的制备，然后用ELISA法筛选含有产生hPD-1特异性IgG的杂交瘤克隆的mini-pool。接着建立了基于双高通量流式细胞术的中和试验，以快速区分hPD-1特异性中和抗体与非中和抗体(图3c)。最终成功分离出5个产生抗PD-1 NAb的小鼠杂瘤mini-pool，并对其进行亚克隆以分离出杂交瘤单克隆用于制备抗PD-1抗体。

图3

为鉴定纯化的小鼠抗PD-1单抗的功能活性，作者测定了其与PD-1结合的活性，以及PD-1/PD-L1结合阻断活性。mCUSB0124具有最低的PD-1/PD-L1结合活性和结合阻断活性。其他4种小鼠抗PD-1单抗具有较高的PD-1结合活性，可抑制PD-1与PD-L1的相互作用，且IC50值较低（图4）。

图4

为鉴定嵌合抗PD-1单克隆抗体的功能活性，作者测定了其与PD-1结合的活性，以及PD-1/PD-L1结合阻断活性。结果显示，xCUSB0124嵌合单抗的结合活性低于其他单抗。xCUSB0126、xCUSB0129和xCUSB0103嵌合单抗表现出较高的PD-1/PD-L1结合阻断活性，而xCUSB0123和xCUSB0124嵌合单克隆抗体的PD-1/PD-L1结合阻断活性低于其他单克隆抗体（图5a,b）。

图5

作者对所有嵌合抗PD-1单抗利用SPR进行结合动力学评估，以确定它们之间的结合率和解离率单抗和目标分子。结果表明，抗PD-1的3个嵌合单克隆抗体（xCUSB0103、xCUSB0126和xCUSB0129），具有较高的PD-1结合活性和PD-1/PD-L1结合阻断活性，与商用抗PD-1抗体相似（图5c）。此外，这些嵌合单抗对hPD-1表现出比商业抗PD-1抗体更高的亲和力。

作者通过MLR实验检测激活细胞因子干扰素γ (IFN-γ)和白细胞介素2 (IL-2)的分泌水平（PerkinElmer）来评估嵌合抗PD-1单抗对T细胞激活的效力（图5d,e）。结果表明，xCUSB0103嵌合mAb可以刺激T细胞反应，其剂量-反应曲线与商业抗PD-1抗体OPDIVO相当（表1）。

Phakham T, Boonkrai C, Wongtangprasert T, et al. Highly efficient hybridoma generation and screening strategy for anti-PD-1 monoclonal antibody development. Sci Rep. 2022 Oct 22;12(1):17792. doi: 10.1038/s41598-022-20560-6.

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