基因治疗的目的是纠正遗传性疾病，即缺失或变异的蛋白质导致的衰弱性疾病。开发安全、可靠、高效的基因转移载体是基因治疗成功的关键之一。携带基因转移的两种最主要的载体是腺相关病毒(AAV)和慢病毒载体(LV)。本文主要介绍可用于基因治疗的病毒颗粒开发和批量测试的不同检测方法的例子。
GLP要求在将AAV颗粒和慢病毒颗粒等基因治疗产品注射到受试者体内之前，对它们进行许多测试，包括对病毒颗粒的生物物理分析，如病毒滴度、载体完整性、转导效率或基因组整合，以及纯度、无菌性、复制缺陷和细胞毒性测试等，以确保安全性和可靠性。
图1基因治疗流程
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病毒滴度(LV&AAV)
在基因治疗中，慢病毒载体通常用于向哺乳动物细胞传递目的基因。最常见的LV来源于人类免疫缺陷病毒(HIV)，它们含有HIV p24 Gag蛋白。因此，p24的量与LV颗粒的数量直接相关，可以用做病毒滴度的测量。
HIV p24 Detection Kit
检测原理是基于HTRF®技术（均匀时间分辨荧光），用于细胞上清中简单快速定量HIV p24，无需包被洗板，可快速替代ELISA。使用Eu（供体荧光素）标记的抗HIV p24抗体和d2（受体荧光素）标记的抗HIV p24抗体，待测物存在时，二者相互靠近，用光源激发供体，触发荧光共振能量转移(FRET)，进而在特定波长(665nm)发出荧光，信号强度与HIV p24的浓度成正比。
图2 HTRF技术检测p24滴度原理
HIV p24 (high sensitivity) AlphaLISA Detection Kit
AlphaLISA是均相、免洗涤检测技术，高灵敏检测试剂盒设计用于定量测定的血清、缓冲溶液或细胞培养基中的HIV p24。一种生物素化的抗p24抗体与链霉亲和素包被的供体微珠结合，另一种抗p24抗体与AlphaLISA受体微珠结合。当待测物存在时，供体微珠和受体微珠相互靠近。使用680nm激光激发供体微珠后与环境中氧发生反应，释放单线态氧扩散至受体微珠，从而检测到615nm波长信号。
图3 HTRF（左）和Alpha（右）技术检测AAV滴度原理
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转导效率
报告基因检测通过在目标细胞中加入生物发光基因，实现了对基因表达和细胞信号的高灵敏度检测。该方法可以用来反映启动子和增强子的强度，确定转录因子的作用，或在药物开发期间评估转染效率。
图4 报告基因试验原理
病毒颗粒的转导效率因物种和目标组织的不同而有较大差异，例如变体AAV-PHP.eB增强的中枢神经系统趋向性在不同的小鼠品系和其他物种中似乎有很大的差异。Huang通过Ly6基因研究该差异发现该基因似乎增强了中枢神经系统的趋向性。他们将Ly6基因家族成员转染到各种细胞系中，用含有荧光素酶基因的AAV9或AAV-HP.eB转导细胞系，并使用Britelite (PerkinElmer)检测转导效率。结果发现与模拟转染的细胞相比，Ly6a增加了HEK293细胞的转导，增加了50倍以上。接下来，他们敲除原代脑细胞(BMVECs)中的Ly6a和Ly6c1基因，并使用Britelite检测转导效率发现转导效率降低了50%（图5）。
图5利用Britelite测定模转染效率
参考文献：
1.Huang Q , Chan K Y , Tobey I G ,et al.Delivering genes across the blood-brain barrier: LY6A, a novel cellular receptor for AAV-PHP.B capsids[J].Cold Spring Harbor Laboratory, 2019(11).
2.Winner LK, Beard H, Hassiotis S, et al. A Preclinical Study Evaluating AAVrh10-Based Gene Therapy for Sanfilippo Syndrome. Hum Gene Ther. 2016 May; 27(5): 363-75.
3.Poirier A, Weetall M, Heinig K, et al.. Risdiplam distributes and increases SMN protein in both the central nervous system and peripheral organs. Pharmacol Res Perspect. 2018 Nov 29; 6(6): e00447.
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