背景导读
细胞因子在正常T细胞介导的免疫、炎症反应、癌症、自身免疫和过敏中都会发挥作用， 因此很多疾病都伴随着细胞因子水平的变化[1]。而外周血单核细胞（PBMC）在体外产生的细胞因子可以作为免疫能力强弱的重要且可靠的衡量标准，因此PBMC通常用作体外模型，用于筛选和鉴定针对靶向免疫途径的药物。测量此类细胞模型的细胞因子分泌的能力往往需要灵敏、稳定的检测方法。
AlphaLISA是一种强大的均相免疫分析技术，以微孔板形式对简单和复杂的基质进行检测。AlphaLISA技术旨在高度灵敏、可定量、可重复且操作友好的工作流程中检测感兴趣的分子，例如测定缓冲液、细胞培养基、血清和血浆中的细胞因子。AlphaLISA的检测基于一对供受体微珠。供体珠在680nm激发下产生单线态氧。单线态氧可以在溶液中扩散约200nm。如果受体珠在该距离内，单线态氧就会转移到受体珠从而产生615nm发生光，AlphaLISA检测信号则与样本中存在的细胞因子的量成正比，原理图如图1所示。
图 1 AlphaLISA原理示意图
实验案例
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实验材料和方法
细胞培养和刺激：梯度分离PBMC，分离的PBMC在含10%FBS的RPMI培养基中培养。对细胞进行计数并以200K个细胞/孔的密度接种在96孔测定板中。用2μg/mL LPS或50μg/mL PMA与1μg/mL离子霉素的组合处理PBMC。过夜刺激后，收集细胞上清液，用于随后测量样品中存在的细胞因子水平，AlphaLISA检测每孔仅需要5μL样品量。
AlphaLISA检测试剂盒：使用以下高性能版细胞因子检测试剂盒以及对应的普通版Human IFN-γ (#AL3153), Human IL-2 (#AL3155), Human TNF-α (#AL3157), Human IL-10 (#AL3159), Human IL-1β (#AL3160), Human IL-17A (#AL3161), Human CXCL10(#AL3163), and Human IL-8 (#AL3164)。
仪器和数据分析：使用EnVision多功能酶标仪Alpha模板读板，在GraphPad Prism®选用具有四参数逻辑方程的非线性回归绘制每个试剂盒的标准曲线。LDL根据12个空白计算，并使用以下等式从标准曲线插值：LDL信号=平均空白+（3x标准偏差空白）。LLOQ是根据12个空白计算的，并使用以下等式从标准曲线插值：LLOQ信号=平均空白+（10x标准偏差空白）。LLOQ值是更具生物学相关性的灵敏度测量值，因为它标志着准确检测到样品中目标分析物的最低水平。
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实验结果分析
图2展示了IL-2检测试剂盒中的标准品曲线图，其中紫色曲线为High Performance款，绿色曲线为普通款。
图2 IL-2 重组蛋白标准曲线
收集了所有测试细胞因子的数据后，计算LDL和LLOQ值。如图3所示，所有的试剂盒的LLOQ都达到pg/mL级别的高灵敏度。
图3 检测下限和定量下限列表
在图4中可见，以IL-2和IFN-γ检测为例，PBMC上清待测样本可进行大倍数稀释或不稀释，都能获得较大的实验窗口。因此，当需要在一个样本中检测多个细胞因子时，则可以选择相同的稀释倍数来稀释样本后再分别进行检测，可减少多种稀释倍数带来的实验干扰与误差，从而更快速准确地获得多个细胞因子的检测数据。同时又因为AlphaLISA检测只需要5-10ul的样本量，一个96样本孔的上清足够同时支持多个细胞因子的检测，大大节省PBMC的使用成本。同时，均相免洗的实验操作以及小体积的检测更兼容自动化仪器，实现真正的高通量样本检测。
图4 检测梯度稀释PBMC 上清中的IFN-γ 、IL-2
总结
总之，高灵敏度和稳定性使得 AlphaLISA 高性能细胞因子检测试剂盒成为细胞因子研究的最佳选择，实现以小样本量准确检测简单到复杂基质中的内源细胞因子。
参考文献
1.Foster, JR (2001) The functions of cytokines and their uses in toxicology. International Journal of Experimental Pathology; 82(3): 171–192
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