HTRF高效&经济替代方案！
Lumit®革新PROTAC体外筛选
PROTACs（蛋白水解靶向嵌合体）是一类异源双功能小分子，通过将靶蛋白募集至E3泛素连接酶附近引导其降解。作为传统抑制剂的替代方案，PROTACs具有显著的治疗潜力。与小分子药物不同，PROTACs可在细胞内循环使用从而实现持续降解，且其结合位点不限于靶蛋白活性位点，这为靶向以往"不可成药"蛋白的新位点创造了机会。
在PROTAC药物研发中，常用的体外筛选技术如HTRF和AlphaLISA，虽然无需繁琐的洗涤步骤，但这些方法操作时间长，且需要特殊且昂贵的仪器，无法做到真正高效且经济的进行药物研发及高通量筛选。
01
Lumit® 和 HTRF 技术对比
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指标 |
HTRF |
Lumit |
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仪器要求 |
高 需专用TR-FRET功能的酶标仪 |
低 仅需具有发光检测功能的酶标仪 |
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试剂价格 |
高 |
中 |
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检测时间 |
大于4小时 可能需要过夜孵育 |
0.5-2小时 |
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动态范围 |
宽 |
更宽 |
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是否均质法 |
均质法 |
均质法 |
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操作步骤 |
加样-检测 |
加样-检测 |
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样品消耗 |
20μl |
20μl |
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适用96/384孔板高通量 |
适用 |
适用 |
02
Lumit® Anti-Tag技术原理及流程
Lumit® Anti-Tag Protein Interaction Reagents以商品化纯化蛋白质的常用亲和纯化标签作为直接分析物，包括：6HiS、GST、FLAG®，生物素以及人lgG。
NanoBiT® 萤光素酶是一种结构互补性报告基因，非常适合进行相互作用研究。NanoBiT® 系统的大亚基（LgBiT；18kDa）和小亚基（SmBiT；11 氨基酸肽），它们分别针对常见蛋白标签的抗体（或链霉亲和素)偶联。当抗标签-LgBiT和抗标签-SmBiT被添加到带有相应标签的相互作用蛋白对时，它们会形成一个功能性酶，在底物存在的情况下产生生物发光信号。
图1.Lumit® Anti-Tag Protein Interaction Reagents检测原理。
图2.Lumit® Anti-Tag Protein Interaction Reagents检测流程。
03
Lumit®用于监测三元复合物形成
以BRD3(BD2)作为目标蛋白，我们使用Lumit® Anti-Tag Protein Interaction Reagents中的Lumit® Anti-DYKDDDDK-LgBiT（识别常用于标记蛋白质的 FLAG® 标签）和Anti-GST-SmBiT监测了PROTAC介导的三元复合物（Cereblon复合物和VHL复合物）形成。
图3. Lumit® Anti-Tag Protein Interaction Reagents可以确定不同PROTAC的相对效力。 上图.与cereblon复合物+BRD3(BD2)和dBET1或dBET6形成的三元复合物。下图. 与VHL复合物+BRD3(BD2)和ARV-771或MZ1形成的三元复合物。这些实验表明dBET6比dBET1更有效力，并且显示出ARV-771和MZ1之间效力相似。在这两个系统中，在高浓度PROTAC下观察到特征性的钩状效应。
04
Lumit® 比HTRF展现出更宽的动态范围
Lumit® Anti-Tag 微量体积反应体系（20µl）与标准体积反应体系（50µl）及HTRF检测体系（20µl）对比，结果表明：
1. Lumit® Anti-Tag微量体积（20µl）与标准体积（50µl）表现出相似的信号背景比，并具有等效的检测灵敏度与线性范围（图4）。
2. 相较于HTRF体系（40倍蛋白稀释范围，20µl体系），微量体积Lumit® Anti-Tag反应体系展现出更宽的动态范围（100倍蛋白稀释范围；表1)，在保持同等灵敏度的前提下可实现更广浓度范围的蛋白检测。
图4.使用Lumit® Anti-Tag Protein Interaction Reagents与HTRF检测法测量蛋白梯度稀释系列。制备了340.1-0.01nM的双标签蛋白(His/FLAG®标签)梯度稀释系列，分别用两种试剂盒进行检测。
上图：50µl与20µl Lumit® Anti-Tag 反应。按照Lumit® Anti-Tag技术手册，在96孔半区板中用Lumit® Anti-6His SmBiT 和Anti-DYKDDDDK LgBiT配制50µl(标准)反应体系，在96孔低体积板中配制20µl反应体系(方法同上，省略抑制剂步骤)。发光信号在GloMax® Discover System上检测。数据表示为平均信背比±标准差(n=3)。检测限(LoD)=平均背景RLU+(3×标准差)，以水平线标示(LoD/平均背景RLU)。拟合线对应50µl或20µl反应体系的线性范围(21.8-0.22nM)。
下图：HTRF 反应。如方案所述1，在96孔低体积板中用抗6His Tb Cryptate Gold单抗和抗FLAG® d2单抗配制20µl(标准)反应体系。HTRF反应在具备时间分辨荧光能量转移(TR-FRET)滤光功能的Tecan Spark® Cyto酶标仪上完成检测。信号比=(665nm信号/620nm信号)×104。数据表示为平均信号比±标准差(n=3)。LoD=平均背景信号比+(3×标准差)，以水平线标示。拟合线对应线性范围(8.71-0.22nM)。
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检测方法 |
格式 |
动态范围 |
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Lumit® Anti-Tag Protein Interaction Reagents, 标准体积 (50μl) |
96-well ½ area |
21.8 – 0.22nM |
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Lumit® Anti-Tag Protein Interaction Reagents, 微量体积 (20μl) |
96-well low volume |
21.8 – 0.22nM |
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HTRF Assay (20μl) |
96-well low volume |
8.71 – 0.22nM |
表1. 检测双标签蛋白(His/FLAG®标签)梯度稀释液时Lumit®与HTRF检测体系形式及动态范围的对比。
HTRF 反应方案参考：
1.Application Note: assays with the Spark® multimode reader’s enhanced fluorescence optics. Tecan publication 400901 v2.0, 2018-10.
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产品 |
示例目录号 |
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Lumit® Anti-6His |
W1600 |
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Lumit® Anti-GST |
W1620 |
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Lumit® Anti-DYKDDDDK* |
W1640 |
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Lumit® Streptavidin |
W1660 |
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Lumit® Anti-Human IgG-LgBiT and -SmBiT |
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Lumit® Detection Reagent A |
VB2010 |
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