表观转录物组学，主要用于研究RNA上的动态可逆的化学修饰、功能及其对基因表达调控的影响。揭示RNA层面的动态化学修饰如何在不改变RNA序列的前提下，影响其稳定性和功能活性，进而调控细胞内各种生物过程。RNA甲基化修饰约占所有RNA修饰的60%以上，而N6甲基腺苷修饰（m6A）是高等生mRNA上最为常见，最丰富且最保守的内部修饰。MeRIP-seq测序，是使用 m6A 特异性抗体免疫沉淀RNA修饰片段，随后进行二代测序，用于研究m6A的结构和功能，不仅能定性地确认m6A的存在，还能在全基因组水平上准确定位m6A修饰位点，为各位老师们提供m6A修饰的全局视图。

老师们在MeRIP-seq测序的实验设计过程中通常会有一些疑问，这些疑问会进而影响到方案设计以及成果转化。因此我们对一些常见问题进行了整理，罗列如下，希望能对您有所帮助。

1. 仅限于真核生物；

2. 物种有完整的参考基因组；

3. 样本提取的RNA质量好，RNA完整性高；

4. RNA总量达到实验的起始量；

1. 动物类样本所需样本量？

RNA：10 μg/样

肝、脾：200 mg/样

细胞（包括贴壁、悬浮）：2x10的7次方/样

心、肾、肺、血管、皮肤，软骨组织、骨等坚韧组织，以及节肢动物：500 mg/样

2. 植物类样本所需样本量？

RNA：10 μg/样

根、茎、叶、花、果实：500 mg/样

3. 真菌类样本所需样本量？

RNA：10 μg/样

真菌菌体沉淀：100 µl干体积

样本详细可见往期微信推文《MeRIP-seq 测序样本准备要点》

1. 代表性原则：根据实验设计或参考相关文献，科学谨慎地选择具有代表性的取样部位；请注意取材精准，不含累赘部位（病变不含正常部位，正常部位不含病变部位）。

2. 一致性原则：组内生物学重复样本，在时间和空间上取材尽可能保持一致，减少变量。

3. 迅速性原则：在样本收集、准备、储存中尽可能做到迅速，缩短样本收集到冻存的时间。

4. 低温性原则：样本离体后，分离及清洗步骤，应置于低温环境（冰盒/碎冰、预冷的PBS/无菌水）中进行；分离好后立即液氮速冻5-10 min，再转至-80℃冰箱或干冰中保存，使用足量干冰运输；需要特别注意要避免样本出现反复冻融的情况。

5. 准确性原则：在样本收集、准备、储存中，需要准确记录样本特征特性并正确标记样本名称；使用厚壁离心管或冻存管收集样本，管口使用 Parafilm 封口，且样本按照实验方案做好分装(自封袋/50 ml离心管)，避免样本管由于冻存出现管裂造成交叉污染；特殊样品可采用干净的锡箔纸包裹样品后装在自封袋中，使用油性记号笔标注样本名称于锡纸及自封袋上。

1. m6A相关蛋白发生明显的表达改变；

2. m6在新兴或复杂生物体系中未被充分探索，为发现新机制提供可能；

3. 特定疾病或生理状态（如发育、应激、老化）相关已发现和m6A修饰相关；

4. 涉及到机制挖掘，理解m6A功能及机制需合适的细胞模型或动物模型提供可控、可重复的实验条件，以模拟疾病或研究特定生物学过程。

1. 利用 LC-MS/MS、比色或Dot Blot技术先检测整体m6A RNA甲基化水平是否发生显著变化；

2. 利用MeRIP-qPCR、Western blot检测 m6A相关蛋白的表达变化；

3. 针对m6A相关蛋白过表达与敲降后表型验证。

可以通过Input数据对照排除背景噪音，来验证m6A富集的效果和检查实验过程IP效果。例如：排除因本底表达水平高或一些非特异性结合所造成的假阳性peaks。

区别在于MeRIP-seq测序时为了达到更高的分辨率，通常需要RNA片段打断的更短（100 nt），其他流程都与常规的转录组测序一致。

建库中对total RN进行目标序列富集后，将富集到的序列一分为二，Inpu样本和IP样本，分别进行后续建库，测序也是平行进行的。在分析环节中会将两个样本的测序数据进行整合分析，得出最终peak结果，并进行后续分析。

不建议。

1. 为了保证分MeRIP数call peak的可信度，需要在相同条件下实验构建IP和Input 文库，以此减少甚至消除会带来假阳peak的因素。RNA-seq的实验处理与MeRIP的实验处理不同，这可能会导致假阳性。

2. MeRIP和RNA-seq片段化程度不同。MeRIP-seq 中，为了使m6A抗体与甲基化的RNA充分结合，需要将RNA片段化至100 n左右。而在RNA-seq中，RN的片段化200~300 nt，片段化条件比较适中。MeRIP-seq的片段化程度比RNA-seq剧烈，这可能会导致某些RN轻微降解，而RNA-seq的片段化条件没那么剧烈，RNA的降解程度MeRI低。所以，RNA-seq的对基因组的覆盖度要比MeRIP Inpu的高，如果用RNA-seq结果作为Input，也可能会带来假阳性。