大肠杆菌广泛用于生物制药生产，残留HCPs(宿主细胞蛋白)的分析是临床试验、下游工艺设计和生物制药质量控制的一个重要问题。大肠杆菌的HCP随亚细胞系的不同而不同，细胞系修饰和发酵条件对HCP种类也有影响。“One for all assay”不能充分代表这种多样性，这也是通用HCP检测方法往往无法达到理想的特异性和灵敏度的原因之一。

增强型E.coli|360-HCP测定法可能是目前使用的通用HCP检测的有价值替代方案，因为它旨在覆盖更广泛的大肠杆菌HCP。这提供了推迟开发耗时的特异性HCP测定的可能性。

E.coli|360-HCP assay是基于W3110和BL21 (DE3)细胞系，它们在两种不同的培养基和条件下发酵，产生四种具有不同HCP 模式的抗原制剂(Figure 1)。

通过用这些抗原免疫动物，开发了四种不同的HCP ELISA试剂盒(A型至D型)，共同构建了增强型E.coli|360-HCP ELISA试剂盒(Table 1)。

对于所有四种分析类型，检测下限(LOD)在0.2-0.5 ng/mL之间， 定量下限(LOQ)为0.6-1.6 ng/mL，工作范围在2 - 100 ng/mL之间 (Figure 2)。

E.coli|360-HCP ELISA抗体(A型至D型)对大肠杆菌HCP抗原具有高特异性。特异性通过Cy5标记的大肠杆菌HCP标准品和相应的抗HCP抗体(detected with anti-goat-IgG-Cy3 conjugate)的2D DIGE Western Blot检测(Figure 3)，并以覆盖率表示(Table 2)。

E.coli|360-HCP ELISA已经在大量模拟大肠杆菌HCP 样本的基础上得到了广泛的测试。所有样品均来自大肠杆菌细胞的模拟发酵，与某些生物制剂的生产过程相对应。对于每个HCP样品，首先用Branford法测定蛋白含量。此外，每个样品使用五种不同的大肠杆菌HCP ELISA试剂盒进行分析:四种增强型通用E.coli|360-HCP试剂盒A至D和一种常用的、市售的试剂盒(Figure 4)。蛋白质回收率以样品Branford值的百分比计算。

每个样品的回收率在很大程度上取决于所使用的ELISA试剂盒 (Figure 4)。对于sample 1，使用B型试剂盒估计回收率为80%。对于sample 2，使用A型试剂盒确定了最佳回收率，使用B型试剂盒和C型试剂盒分别可获得63%和64%的回收率。使用D型试剂盒，估计回收率仅为6%。对于样品5，仅使用D型试剂盒测定了足够的回收率，使用其他3种试剂盒测定的回收率低于30%。市售友商试剂盒显示所有样品的回收率低于30%。回收率高于100%都是overestimation。

由于仅关于回收的信息不足以决定最佳试剂盒或抗体的合格选择，应参考其他方法。由于sample 2在使用B和C试剂盒时显示出几乎相似的回收率，而使用D试剂盒时几乎没有回收率，因此对样品进行了进一步研究。

为了评估sample 2(大肠杆菌模拟HCP)的蛋白质覆盖率，使用Cy5标记的sample 2和四种检测抗体A至D(用抗山羊IgG - Cy3偶联物检测) 进行2D DIGE Western Blots。(Figure 5)。

对于所有四种抗体类型，都显示出超过70%的覆盖率。A型抗体的覆盖率接近90%。但即使是D型抗体，也确定了72%的可接受的覆盖率。对sample 2中试剂盒D型的估计回收率和使用D型抗体计算的72%覆盖率进行比较，表明这两个信息之间没有相关性。覆盖率分析提供了有关HCP抗体pool检测某些特定HCP的能力的信息，但不提供有关特定HCP种类与相应抗体之间的定量关系的信息。因此，我们强烈建议用2D分析等正交方法验证 ELISA获得的数据。

根据上述数据，我们得出结论：没有适用于所有样品的“一种检测方法”。增强型E.coli|360-HCP ELISA提供四种不同的抗体类型，科学家可以快速轻松地为特定工艺选择最合适的抗体。

来源于优宁维药物研发官网